GPR30在小鼠海馬的表達(dá)及對(duì)actin細(xì)胞骨架重塑的調(diào)控與機(jī)制的初步研究.pdf

1、阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease)簡(jiǎn)稱AD，是一種逐漸進(jìn)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是老年癡呆最常見(jiàn)的類型，占所有癡呆病例的50％到75%。臨床上主要以記憶障礙、失語(yǔ)、失認(rèn)、視空間技能損害、執(zhí)行功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆特征。由于起病緩慢或隱匿，至今還未發(fā)現(xiàn)有效的治療措施。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年全球癡呆患者人數(shù)已達(dá)4680萬(wàn)人，其中50%-75%為阿爾茨海默病患者。目前，中國(guó)阿爾茨海默病患者人數(shù)已居世界第一。而全

2、球癡呆患者每20年增加一倍，預(yù)計(jì)到2050年將達(dá)到1.31億人。目前，老年癡呆已經(jīng)成為老齡化社會(huì)主要致死和致殘的疾病之一，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。
　　眾多研究發(fā)現(xiàn)，老年癡呆患者中，女性多于男性，呈3:1的發(fā)病幾率并且多見(jiàn)于絕經(jīng)后的女性。因此，老化導(dǎo)致的卵巢雌激素下降被認(rèn)為是老年癡呆患病的主要原因之一。腦內(nèi)雌激素有兩條來(lái)源途徑，一是源于卵巢的循環(huán)雌激素，另外一條是腦內(nèi)的雄激素經(jīng)芳香化酶催化轉(zhuǎn)化而來(lái)的雌激素即腦源性雌激素。海馬

3、是腦內(nèi)的重要結(jié)構(gòu)，與學(xué)習(xí)記憶與認(rèn)知密切相關(guān)。大量文獻(xiàn)證實(shí)循環(huán)雌激素具有強(qiáng)大的神經(jīng)保護(hù)作用，而且雌激素能夠明顯改善認(rèn)知記憶，因此雌激素替代已經(jīng)用于臨床試驗(yàn)，但其有無(wú)療效與副作用尚不明確，其調(diào)節(jié)海馬突觸可塑性的機(jī)制尚不清楚。前人和課題組既往研究均證實(shí)海馬有較高水平的芳香化酶表達(dá)，且海馬源性雌激素對(duì)海馬的結(jié)構(gòu)和功能也具有重要的調(diào)節(jié)作用，然而其具體調(diào)節(jié)機(jī)制同樣不清楚。
　　突觸可塑性包括突觸形態(tài)的可塑性(突觸形態(tài)、密度以及樹(shù)突棘密度等)是

4、學(xué)習(xí)記憶的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)卵巢切除能導(dǎo)致海馬突觸密度和樹(shù)突棘密度顯著下降且雌激素替代可逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象，表明卵巢雌激素可調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞骨架。我們近期工作發(fā)現(xiàn)用芳香化酶抑制劑來(lái)曲唑處理能抑制海馬CA1突觸密度以及突觸后膜厚度顯著下降，提示海馬源性雌激素也參與了對(duì)細(xì)胞骨架重塑的調(diào)節(jié)。然而，兩種來(lái)源的雌激素是如何調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元細(xì)胞骨架？對(duì)此問(wèn)題目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　眾所周知，actin是最重要的細(xì)胞骨架蛋白之一，對(duì)細(xì)胞形態(tài)的可塑性與維持極

5、為重要。單體球狀肌動(dòng)蛋(G-actin)與聚合態(tài)的纖維肌動(dòng)蛋白(F-actin)的動(dòng)態(tài)變化是突觸可塑性的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)Profilin和 Jasplakinolide(海綿 Jaspis johnstoni的大環(huán)肽天然產(chǎn)物，JPK)可以促進(jìn)G-actin聚合為F-actin，而cofilin和細(xì)胞松弛素 D(CytoD)則可以促進(jìn) F-actin解聚為 G-actin。Rictor(rapamycin-insensitive compa

6、nion of mTOR)是不依賴?yán)着撩顾氐睦着撩顾夭溉閯?dòng)物靶蛋白復(fù)合體2(mTORC2)的核心成分。研究發(fā)現(xiàn)Rictor對(duì)actin細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化具有重要的調(diào)節(jié)作用，其通過(guò)磷酸化AKT促進(jìn)actin的聚合是短時(shí)記憶能夠得以鞏固并轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)時(shí)記憶的關(guān)鍵。已有研究經(jīng)發(fā)現(xiàn)雌激素在外周組織中以及海馬神經(jīng)元中均可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的聚合，然而其具體機(jī)制尚不明確。
　　雌激素可以通過(guò)兩條途徑發(fā)揮其作用。經(jīng)典的作用方式為雌激素與其核受體(ERα

7、和ERβ)結(jié)合發(fā)揮其調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的效應(yīng)，另外一種是雌激素與其膜受體結(jié)合發(fā)揮其快速的非基因調(diào)控效應(yīng)。GPR30(G Protein-coupled Receptor30)或GPER(G Protein-coupled Estrogen Receptor)屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的雌激素膜受體，雌激素與其結(jié)合之后能夠啟動(dòng)胞外第二信使途徑發(fā)揮快速的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，雌激素膜受體GPR30廣泛表達(dá)于海馬并且能夠調(diào)節(jié)突觸蛋白的表達(dá)

8、進(jìn)而在學(xué)習(xí)記憶中發(fā)揮作用，但其是否介導(dǎo)了雌激素對(duì)海馬神經(jīng)元actin細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)以及具體的調(diào)節(jié)機(jī)制目前還不清楚。為了探究GPR30調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元actin細(xì)胞骨架的具體機(jī)制，在本課題進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)研究：
　　1.用免疫組化(IHC)和免疫印跡(Western blot,WB)檢測(cè)了生后到成年時(shí)期以及卵巢切除和來(lái)曲唑處理后海馬GPR30以及actin細(xì)胞骨架聚合蛋白Profilin-1的表達(dá)變化；
　　2.采用卵巢切除(OV

9、X)、OVX+GPR30激動(dòng)劑G1以及GPR30拮抗劑G15等方法處理小鼠，然后用Morris水迷宮方法檢測(cè)了動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶行為的變化、用高爾基鍍銀染色法檢測(cè)了海馬樹(shù)突棘密度的變化；用WB檢測(cè)了海馬雌激素核受體及其輔助活化因子SRC-1、Rictor及其下游效應(yīng)分子AKT、actin細(xì)胞骨架聚合調(diào)節(jié)蛋白Profilin-1和cofilin、重要突觸蛋白PSD95與GluR1等分子表達(dá)的變化以及F-actin/G-actin比例的變化。

10、r>　　3.利用mHippoE-14海馬神經(jīng)元細(xì)胞株，單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用G1、G15、SRC-1特異性抑制劑蟾毒靈(Bufalin,Bu)、PI3K抑制劑渥曼青霉素(Wortmannin,WM)、JPK和CytoD處理，然后檢測(cè)actin細(xì)胞骨架聚合調(diào)節(jié)蛋白以及突觸蛋白的表達(dá)變化。
　　主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1. GPR30在生后( P0-P56)小鼠海馬的表達(dá)隨發(fā)育水平呈逐漸遞增的趨勢(shì)。其中， P0的表達(dá)量最低，P56的表達(dá)量最

11、高。OVX和LET處理一周均能顯著下調(diào)海馬GPR30的表達(dá)。Profilin-1的變化與此類似。此外，OVX和LET能顯著下調(diào)actin聚合蛋白Profilin-1的表達(dá)并顯著抑制actin的聚合(F-actin/G-actin比例顯著下降)。
　　2. OVX能誘導(dǎo)小鼠明顯的學(xué)習(xí)記憶下降，顯著下調(diào)樹(shù)突棘密度、雌激素核受體以及SRC-1、突觸蛋白、Rictor、細(xì)胞骨架聚合調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)以及F-actin/G-actin的比值。G

12、PR30激動(dòng)劑G1能逆轉(zhuǎn)OVX所致的學(xué)習(xí)記憶行為下降以及上述分子表達(dá)的下降。GPR30抑制劑G15則能模擬OVX的上述效應(yīng)。
　　3.離體實(shí)驗(yàn)中，G1能顯著上調(diào)細(xì)胞骨架聚合蛋白、Rictor、SRC-1和突觸蛋白的表達(dá)，而G15能明顯抑制上述分子的表達(dá)；SRC-1抑制劑蟾毒靈Bu與G1聯(lián)合處理能拮抗G1的激動(dòng)效應(yīng)，WM與G1聯(lián)合處理后G1的激動(dòng)效應(yīng)也被拮抗；JPK對(duì)細(xì)胞骨架聚合和突觸蛋白表達(dá)的促進(jìn)效應(yīng)能夠被G15所抑制，而G1對(duì)a

13、ctin聚合以及突觸蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用能被CytoD所阻斷。
　　主要結(jié)論：
　　1.從生后到成年，海馬GPR30和actin聚合蛋白Profilin-1的表達(dá)隨發(fā)育水平呈逐漸遞增且均受卵巢雌激素和海馬源性雌激素的調(diào)節(jié)，提示GPR30可能參與了雌激素對(duì)海馬actin細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)。
　　2.卵巢去勢(shì)顯著抑制細(xì)胞骨架聚合并導(dǎo)致樹(shù)突棘密度的下降以及學(xué)習(xí)記憶下降，G1和G15分別能逆轉(zhuǎn)或模擬卵巢去勢(shì)所導(dǎo)致的上述效應(yīng)，證實(shí)GP