TLR2介導(dǎo) AKT1信號通路基因多態(tài)性與漢族散發(fā)性帕金森病的關(guān)系.pdf

1、研究目的：帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，典型的病理表現(xiàn)是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性變性缺失，殘存的多巴胺能神經(jīng)元胞漿內(nèi)異常蛋白聚集體——路易小體(Lewy bodies，LBs)，LBs由錯誤折疊的α-突觸核蛋白組成。編碼α-突觸核蛋白的SNCA基因是第一個被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致帕金森病的遺傳因素。帕金森病是一個復(fù)雜基因疾病，普遍被認(rèn)為是由環(huán)境-遺傳因素交互作用所致。天然免疫受體

2、調(diào)控改變腦老化的過程，尤其是在慢性炎癥的微環(huán)境長期作用之下，機(jī)體發(fā)生與衰老密切相關(guān)的神經(jīng)退化過程，這一系列發(fā)生發(fā)展機(jī)制可能受到遺傳易感性影響。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是最重要的免疫受體家族之一，參與人體多項免疫過程，TLRs在腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞表面高度表達(dá)，激活免疫系統(tǒng)，調(diào)節(jié)T細(xì)胞抗炎。隨著年紀(jì)增長，個體暴露在慢性炎癥環(huán)境中的危險度也越高，TLR2作為TLRs家族中最重要的固有免疫受體，介導(dǎo)的炎癥反

3、應(yīng)在老年退行性疾病中具有重要作用。環(huán)境-基因具有相互影響的作用，因此免疫相關(guān)基因位點的突變及遺傳多態(tài)性可能是個體易感的重要部分。TLR2通過多種不同的機(jī)制激活核因子 kB(Nuclear factor kB, NF-kB)引發(fā)炎癥反應(yīng)，包括 TLR2介導(dǎo)的 PI3K（Phosphatidylinositol-3-kinase）/AKT信號通路。研究證實，TLR2活化P38及其下游受體的功能，能調(diào)節(jié)細(xì)胞中經(jīng)由PI3K-AKT依賴途徑的NF

4、-KB的轉(zhuǎn)錄活性。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細(xì)胞內(nèi)信號通路中起重要作用，作為PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要中間分子，AKT1參與多種細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝,在多個細(xì)胞反應(yīng)的調(diào)控中起重要作用，包括增殖、細(xì)胞周期、分化、存活和凋亡，對細(xì)胞存活至關(guān)重要。目前學(xué)者們發(fā)現(xiàn)了超過26個基因位點和帕金森病有關(guān)，約5-10％的帕金森病患者存在單基因突變，其中一些基因參與的蛋白質(zhì)錯誤折疊和降解，線粒體損傷和氧化應(yīng)激等一系列細(xì)胞機(jī)制。家族性帕金森病約

5、占10%，但是帕金森病人中絕大多數(shù)為散發(fā)病例，現(xiàn)有的遺傳發(fā)現(xiàn)不能夠完全解釋散發(fā)性帕金森病的病因病理，散發(fā)帕金森病發(fā)病機(jī)制仍然需要進(jìn)一步闡明。隨著信號通路更多作用被發(fā)現(xiàn)和人們對基因多態(tài)性的深入理解，TLR2介導(dǎo) AKT1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與神經(jīng)炎癥的機(jī)制，在帕金森病發(fā)病風(fēng)險，尤其是散發(fā)性帕金森病中的角色和作用值得探討?；蚨鄳B(tài)性對帕金森病風(fēng)險的影響取決于不同種族和人群。目前缺乏TLR2及AKT1基因多態(tài)性在漢族帕金森病人群中的研究。我們在這里

6、探討免疫遺傳變異和散發(fā)性帕金森病患者之間的相互作用。我們假設(shè)TLR2和AKT1中的基因突變可能是帕金森病的風(fēng)險因素，并且造成細(xì)胞先天免疫力的降低，從而影響種族人群中的帕金森病發(fā)病風(fēng)險。因此，我們設(shè)計一項病例對照研究，根據(jù)設(shè)計特點，后期為了更好控制混雜因素，采用Logistic回歸分析，OR作為結(jié)局相對危險度的近似估計，反應(yīng)年齡、性別等暴露因素與帕金森病發(fā)生風(fēng)險之間的關(guān)系。使用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-Restricti

7、on fragment length polymorphism, PCR-RFLP）方法探討在漢族北方漢族人群中，TLR2基因和 AKT1基因的單核苷酸多態(tài)性（Single-Nucleotide polymorphism，SNP）： rs3804099，rs3804100(TLR2)；和 rs2498799，rs2494732、rs1130214(AKT1)的對散發(fā)性帕金森病的遺傳變異作用，并根據(jù)發(fā)病年齡和性別進(jìn)行分層分析，調(diào)查不同漢族

8、人群中的帕金森病風(fēng)險相關(guān)度。
　　研究方法：采取病例-對照研究方法，病例組受試者主要來自山東、北京、天津、河北、山西、河南等省份地區(qū)的散發(fā)性帕金森病患者。納入病例均為漢族，根據(jù)英國帕金森病協(xié)會腦庫標(biāo)準(zhǔn)，由2名運動障礙專家診斷散發(fā)性帕金森病。根據(jù)國際分類標(biāo)準(zhǔn)，定義發(fā)病年齡<50歲為早發(fā)型帕金森病，發(fā)病年齡≥50歲為晚發(fā)型帕金森病。對照組是與病例組年齡、性別匹配的正常健康人，均來自北方省份漢族人群。使用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)

9、性（PCR-RFLP）方法對病例組和對照組進(jìn)行基因檢測。首先使用相關(guān)數(shù)據(jù)庫及軟件查詢SNP位點信息，選擇相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶，并根據(jù)不同位點序列設(shè)計相應(yīng)的擴(kuò)增引物，并合成引物，其次提取納入受試者血液基因組DNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng)，通過紫外線透射儀成像，統(tǒng)計SNP位點基因型頻率。最后驗證實驗結(jié)果，隨機(jī)選擇10%樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序，檢測基因型并與以上 RFLP酶切結(jié)果進(jìn)行比對。所得基因型數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0

10、進(jìn)行相關(guān)處理和統(tǒng)計分析。應(yīng)用卡方檢驗、Logistic回歸檢驗各個SNP位點基因型、等位基因頻率差異及對顯性遺傳模式、隱性遺傳模式進(jìn)行分析，并預(yù)測基因-疾病風(fēng)險關(guān)聯(lián)。
　　結(jié)果：① TLR2基因的SNPrs3804099在散發(fā)性帕金森病患者中等位基因T頻率高于健康匹配對照，增加散發(fā)性帕金森病風(fēng)險（OR=1.293,95％CI=1.044-1.601，P=0.019），顯性遺傳模型TT/TC+CC分布在病例組與夫?qū)φ战M之間有顯著差異

11、，顯示與散發(fā)性帕金森病相關(guān)，增加發(fā)病風(fēng)險（OR=1.376,95％CI=1.043-1.814，P=024）。進(jìn)一步進(jìn)行年齡/性別亞組分析，等位基因 T在晚發(fā)型散發(fā)性帕金森病患者中分布（73.1％）高于對照健康人群（67.4％），與對照組相比具有顯著差異，增加散發(fā)性帕金森病風(fēng)險（OR=1.319,95％CI=1.047-1.663，P=0.019）。此外，校正性別因素后，采用Logistic回歸分析，顯示晚發(fā)人群中rs3804099顯性

12、遺傳模型(TT/TC+CC)在散發(fā)性帕金森病患者和健康對照之間的具有顯著差異（OR=1.417,95％CI=1.051-1.911，P=022）。②AKT1基因的SNPrs2498799位點等位基因G頻率在散發(fā)性帕金森病患者和對照組之間的有顯著差異，對發(fā)病風(fēng)險具有保護(hù)作用（OR=0.764,95％CI=0.587-0.995，P=0.045）。校正年齡因素后，采用Logistic回歸分析顯示GG/GA+AA在女性散發(fā)性帕金森病人群與對照

13、組比較分布有顯著差異，對發(fā)病風(fēng)險具有保護(hù)作用（OR=0.538,95％CI=0.345-0.841，P=0.006），再進(jìn)一步將女性人群分為早發(fā)型和晚發(fā)型，發(fā)現(xiàn)在女性晚發(fā)散發(fā)帕金森病隊列中GG/GA+AA分布在病例-對照組間仍然存在顯著差異，并對發(fā)病風(fēng)險具有保護(hù)作用（OR=0.521,95％CI=0.309-0.877，P=0.012）。
　　結(jié)論：TLR2基因SNPrs3804099多態(tài)性位點與漢族北部人群散發(fā)帕金森病相關(guān)聯(lián)，通

14、過進(jìn)一步性別/年齡亞組分析可以看出，晚發(fā)帕金森病人群中rs3804099顯性遺傳模型TT/TC+CC增加發(fā)病風(fēng)險。一直以來，免疫功能障礙被認(rèn)為是老年帕金森病人的重要發(fā)病機(jī)制，因此免疫相關(guān)基因位點的遺傳多態(tài)性可能是個體易感性的重要部分，同時長期慢性炎癥可能導(dǎo)致基因位點發(fā)生突變。根據(jù)這一系列的推論和結(jié)果綜合看來，我們考慮TLR2 rs3804099 T攜帶者可能更容易受炎癥介導(dǎo)的影響，特別是對于晚發(fā)性帕金森病人群來說,更具有免疫相關(guān)基因遺傳

15、易感性，通過免疫介導(dǎo)途徑在TLR2基因rs3804099風(fēng)險基因型攜帶者中發(fā)病。AKT1基因rs2498799位點在漢族北部女性人群中具有帕金森病保護(hù)作用。尤其是老年女性人群，等位基因 G具有疾病保護(hù)作用。AKT1是參與不同信號傳導(dǎo)途徑的重要成員，相信隨著 AKT1更多的作用被發(fā)現(xiàn)及其基因遺傳效應(yīng)的深入挖掘，我們在分子遺傳水平上能夠有更加透徹的認(rèn)識。TLR2和 AKT1基因多態(tài)性均與中國北方漢族散發(fā)性帕金森病的人群具有風(fēng)險關(guān)聯(lián)。我們可以