RSV感染鼠肺組織內(nèi)IL-33來(lái)源細(xì)胞及其產(chǎn)生機(jī)制的研究.pdf

1、目的:哮喘是由多種細(xì)胞及炎性因子共同參與的免疫性疾病。固有免疫細(xì)胞包括嗜酸粒細(xì)胞以及適應(yīng)性免疫細(xì)胞如Th2細(xì)胞均參與哮喘的發(fā)生發(fā)展。呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)與哮喘的關(guān)系一直受到研究學(xué)者的密切關(guān)注。嬰幼兒RSV感染后100％出現(xiàn)呼吸困難、喘息、哮鳴以及紫紺等哮喘樣癥狀。然而，盡管有研究表明RSV感染可能通過(guò)誘導(dǎo)Th2細(xì)胞分泌更多的Th2型細(xì)胞因子進(jìn)而誘發(fā)或加重哮喘，但常規(guī)的哮喘治療藥

2、物對(duì)其治療效果不佳，提示在RSV感染誘發(fā)哮喘的發(fā)生發(fā)展中存在著不同于Th2型細(xì)胞的某些致病機(jī)制或途徑。那么其他免疫細(xì)胞，尤其是肺泡巨噬細(xì)胞，樹(shù)突狀細(xì)胞這類存在于肺組織局部的重要的固有免疫細(xì)胞，在RSV病毒感染誘發(fā)的哮喘樣癥狀的發(fā)生中具有怎樣的生物學(xué)作用及其作用機(jī)制如何，目前尚不清楚。
　　IL-33是新近發(fā)現(xiàn)的IL-1家族細(xì)胞因子。研究顯示IL-33/ST2途徑在超敏反應(yīng)性疾病的形成和發(fā)作中占有重要地位。嚴(yán)重哮喘患者肺支氣管上皮細(xì)

3、胞高水平表達(dá)IL-33 mRNA，IL-33通過(guò)與Th2細(xì)胞表面ST2受體結(jié)合，誘導(dǎo)其分泌Th2型細(xì)胞因子。用抗IL-33或抗ST2單克隆抗體處理小鼠可抑制變應(yīng)原特異性Th2細(xì)胞的活化，減輕嗜酸性粒細(xì)胞肺浸潤(rùn)，降低氣道高反應(yīng)性。以上結(jié)果提示IL-33可能參與介導(dǎo)哮喘的發(fā)生和發(fā)展。
　　體內(nèi)多種細(xì)胞分泌IL-33。除上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等這類非免疫細(xì)胞外，巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞等亦可在某些刺激因素作

4、用下分泌IL-33。研究發(fā)現(xiàn)在流感病毒H3N1誘導(dǎo)的哮喘鼠模型中，肺泡巨噬細(xì)胞表達(dá)IL-33明顯增加，進(jìn)而加重了哮喘的發(fā)生發(fā)展。
　　那么在RSV感染誘發(fā)的哮喘樣癥狀的發(fā)生過(guò)程中，IL-33是否亦參與其中？RSV感染模型鼠肺組織局部的固有免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞是否也可在RSV感染的刺激下分泌IL-33?其合成機(jī)制如何？諸多問(wèn)題亟需解決。本研究利用HE染色、熒光實(shí)時(shí)定量技術(shù)，流式細(xì)胞術(shù)，免疫印跡等實(shí)驗(yàn)方法，旨在證實(shí)細(xì)胞因子

5、IL-33參與RSV感染誘發(fā)的哮喘樣癥狀發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，明確RSV感染模型鼠肺組織局部分泌IL-33的固有細(xì)胞類型，并進(jìn)一步探討其分泌IL-33的機(jī)制。
　　研究方法:1、HEp-2細(xì)胞增殖人類呼吸道合胞病毒A2型，采用30％蔗糖超速離心法分離純化病毒粒子，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ山M織細(xì)胞半數(shù)感染量（50％tissue culture infections dose，TCID50）表示病毒滴度。
　　2、實(shí)驗(yàn)組由RSV病毒

6、懸液(1×107 p.fu.RSV/20μl)經(jīng)鼻粘膜感染BALB/c小鼠。對(duì)照組由同等體積的無(wú)菌PBS溶液經(jīng)鼻黏膜感染BALB/c小鼠。
　　3、0.05ml7.2％水合氯醛腹腔注射深度麻醉BALB/c小鼠，心臟灌流去除肺血管內(nèi)血細(xì)胞后摘取肺組織至預(yù)冷的PBS中沖洗。收集肺泡灌洗液，重懸細(xì)胞沉淀，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)并制備細(xì)胞涂片，Diff-Quick染色后顯微鏡下隨機(jī)選擇視野，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，依據(jù)形態(tài)學(xué)特點(diǎn)分別計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞、嗜酸性

7、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量。
　　4、收集肺組織，多聚甲醛中固定BALB/c小鼠肺組織，梯度乙醇逐級(jí)脫水，隨后經(jīng)過(guò)石蠟包埋、切片后進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及炎癥反應(yīng)情況。
　　5、用含有消化酶的1640培養(yǎng)液，37℃恒溫?fù)u床消化肺組織60～90分鐘后經(jīng)過(guò)300目鋼網(wǎng)收集小鼠肺組織單細(xì)胞懸液。
　　6、調(diào)整小鼠肺組織細(xì)胞懸液濃度，用FITC-anti-CD45 mAb、APC-anti-CD11cm

8、Ab及PE/cy7-anti-F4/80 mAb的抗體標(biāo)記肺組織細(xì)胞，利用流式細(xì)胞技術(shù)監(jiān)測(cè)RSV感染小鼠肺組織局部肺泡巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、間質(zhì)巨噬細(xì)胞數(shù)量變化，此外，利用流式細(xì)胞術(shù)內(nèi)因子染色法檢測(cè)IL-33+肺泡巨噬細(xì)胞、IL-33+間質(zhì)巨噬細(xì)胞、IL-33+樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)量的改變。
　　7、調(diào)整肺組織單細(xì)胞懸液濃度，利用流式細(xì)胞分選技術(shù)及磁珠分選技術(shù)分離CD11 c+F4/80+的肺泡巨噬細(xì)胞;F4/80磁珠陰性選擇后在經(jīng)過(guò)CD

9、11c磁珠陽(yáng)性選擇得到CD11 c+F4/80-的細(xì)胞為肺組織樹(shù)突狀細(xì)胞;CD11c磁珠陰性選擇后在經(jīng)過(guò)F4/80磁珠陽(yáng)性選擇得到CD11c-F4/80+的細(xì)胞即為肺組織間質(zhì)巨噬細(xì)胞。
　　8、分選RSV感染小鼠肺組織局部固有免疫細(xì)胞，提取其總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)IL-33 mRNA的改變。同時(shí)檢測(cè)肺組織局部固有免疫細(xì)胞表面TLR3、TLR4、TLR7 mRNA的改變。分選RSV感染小鼠肺組織固有免疫

10、細(xì)胞，1×105細(xì)胞/孔平鋪于96孔板，加入TLR3、TLR7特異性激活劑或者抑制劑，體外共培養(yǎng)24小時(shí)后，收集細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)IL-33的表達(dá)水平。
　　9、磁珠分選肺泡巨噬細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)RSV感染后肺泡巨噬細(xì)胞表達(dá)p38，JNK，ERK，NF-κB mRNA的水平。巨噬細(xì)胞系RAW264.7體外培養(yǎng)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RSV感染，PCR技

11、術(shù)及免疫印跡技術(shù)檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)p38，JNK，ERK，NF-κB mRNA及其蛋白水平的改變。利用免疫印跡的技術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)JNK，ERK，p38，NF-κB等信號(hào)蛋白磷酸化水平，并利用阻斷實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證JNK，ERK，p38，NF-κB是否參與RSV介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌IL-33的過(guò)程。
　　結(jié)果:1、成功建立RSV急性感染鼠模型，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)RSV感染的BALB/c小鼠肺組織內(nèi)IL-33 mRNA的表達(dá)

12、明顯升高，HE病理組織染色見(jiàn)肺組織局部有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。用抗IL-33的單克隆抗體預(yù)處理RSV感染鼠，發(fā)現(xiàn)BALB/c小鼠肺組織局部炎性反應(yīng)減輕，嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量及浸潤(rùn)明顯下降，提示IL-33參與RSV介導(dǎo)急性非過(guò)敏性哮喘的發(fā)生發(fā)展。
　　2、利用流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)RSV感染鼠肺組織內(nèi)肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)量及IL-33+的肺泡巨噬細(xì)胞有明顯升高。利用流式細(xì)胞分選技術(shù)及磁珠分選技術(shù)分選RSV感染鼠肺泡巨噬細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)到肺

13、泡巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-33 mRNA的表達(dá)明顯上升。此外，RSV體外感染巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞亦檢測(cè)到IL-33 mRNA的高表達(dá)，提示肺組織局部的固有免疫細(xì)胞，尤其是肺泡巨噬細(xì)胞在RSV感染過(guò)程中可能是IL-33的重要來(lái)源細(xì)胞之一。
　　3、利用流式細(xì)胞染色技術(shù)檢測(cè)RSV感染鼠肺組織內(nèi)樹(shù)突狀細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型鼠肺組織內(nèi)樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有明顯變化，然而IL-33+的樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)。磁珠分選技術(shù)分選RSV感

14、染鼠肺組織局部樹(shù)突狀細(xì)胞，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)RSV感染誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞內(nèi)IL-33 mRNA的高表達(dá)。此外，RSV體外感染樹(shù)突狀細(xì)胞系DC2.4同樣檢測(cè)到其IL-33 mRNA的高表達(dá)，提示在RSV感染過(guò)程中，肺組織局部樹(shù)突狀細(xì)胞亦是IL-33的來(lái)源細(xì)胞之一。
　　4、同樣采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞數(shù)量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在RSV感染過(guò)程中肺組織局部間質(zhì)巨噬細(xì)胞數(shù)量及IL-33+的間質(zhì)巨噬細(xì)胞數(shù)量均沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明

15、肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞在RSV感染過(guò)程中不是IL-33的來(lái)源細(xì)胞。
　　5、利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)檢測(cè)RSV感染鼠肺組織局部固有免疫細(xì)胞內(nèi)TLR表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，肺泡巨噬細(xì)胞及肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)TLR3，TLR4，TLR7的表達(dá)明顯升高，尤其是TLR7的升高最為明顯，提示在RSV感染過(guò)程中，肺固有免疫細(xì)胞可能通過(guò)TLR7或者TLR3的途徑介導(dǎo)IL-33的表達(dá)。
　　6、利用TLR受體激活劑及阻斷劑檢測(cè)TLR是否在RSV介導(dǎo)IL-

16、33在固有免疫細(xì)胞中發(fā)揮作用。在TLR3，TLR7激活劑的刺激下，RSV感染的肺泡巨噬細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞分泌IL-33的水平明顯升高。此外，TLR3及TLR7的特異性阻斷劑成功阻斷了肺泡巨噬細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞IL-33 mRNA的表達(dá)，提示肺泡巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞通過(guò)TLR3或者TLR7的途徑參與RSV介導(dǎo)急性哮喘的發(fā)生發(fā)展。
　　7、磁珠分選RSV感染鼠肺組織局部肺泡巨噬細(xì)胞，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)JNK1/2 mRNA的表

17、達(dá)明顯上升;RSV體外感染巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞同樣檢測(cè)到JNK1/2 mRNA及其蛋白的高水平表達(dá)。此外，免疫印跡技術(shù)監(jiān)測(cè)到RSV感染介導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)JNK蛋白分子的磷酸化，提示JNK參與RSV介導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞分泌IL-33的過(guò)程。JNK的特異性阻斷劑成功降低了RSV感染的巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-33的分泌水平，證實(shí)了以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　8、同樣采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及免疫印跡的方法，檢測(cè)到RSV感染鼠肺組織肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)p3

18、8及ERK1/2 mRNA的表達(dá)量明顯升高;在RSV感染的巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞內(nèi)同樣檢測(cè)到p38、ERK1/2 mRNA和蛋白的高水平表達(dá)。RSV感染亦活化了巨噬細(xì)胞內(nèi)的p38、ERK磷酸化蛋白分子。此外，p38及ERK的特異性阻斷劑成功阻斷了IL-33在RSV感染的巨噬細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，證實(shí)p38及ERK參與RSV介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌IL-33的過(guò)程。
　　9、利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及免疫印跡技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)了NF-κB是否

19、在RSV介導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)IL-33的過(guò)程中發(fā)揮作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NF-κB無(wú)論在基因水平還是蛋白水平均沒(méi)有明顯變化;并且RSV感染并沒(méi)有誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB蛋白的磷酸化，說(shuō)明在RSV介導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞分泌IL-33的過(guò)程中NF-κB未發(fā)揮作用。
　　結(jié)論:1、肺泡巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞是RSV感染過(guò)程中IL-33的主要來(lái)源細(xì)胞。2、RSV感染誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)IL-33的過(guò)程依賴于TLR3或者TLR7的途徑。3、在RS