人肺腺癌厄洛替尼耐藥細(xì)胞PC9-ER的建立及奧曲肽改善耐藥機(jī)制探討.pdf

1、背景和目的:
　　肺癌是全球死亡率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。肺癌中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占80％～85％。近年來，表皮生長(zhǎng)因子酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）成功應(yīng)用于臨床，對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor r

2、eceptor，EGFR)基因突變的肺癌患者有良好的療效。然而，不幸的是多數(shù)原本敏感的NSCLC患者在接受厄洛替尼等TKI治療6～12個(gè)月后會(huì)發(fā)生耐藥而致腫瘤復(fù)發(fā)。因此，EGFR-TKIs獲得性耐藥機(jī)制成為目前研究的熱點(diǎn)。
　　現(xiàn)有研究表明，EGFR-TKIs獲得性耐藥的機(jī)制涉及EGFR T790M二次突變、C-MET基因擴(kuò)增、以及IGF-1R旁路激活等有方面。IGF-1R旁路激活是指EGFR-TKIs抑制敏感的NSCLC細(xì)胞增殖

3、和遷徙的同時(shí)，也誘導(dǎo)胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(Insulinlike growth factor1 receptor，IGF-1R)的高表達(dá)，并以旁路激活的方式激活下游的PI3K/Akt通路，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞持續(xù)增殖，抑制凋亡，從而對(duì)EGFR-TKIs耐藥。奧曲肽（octreotide，OCT）是一種人工合成的多肽，不僅有抑制腫瘤增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，還能調(diào)控IGF-1的轉(zhuǎn)錄并抑制IGF-1的分泌，理論上有改善EGFR-TKIs耐藥的

4、作用，但目前尚未見相關(guān)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬在通過厄洛替尼誘導(dǎo)人肺腺癌PC9細(xì)胞耐藥的基礎(chǔ)上，探討OCT能否改善厄洛替尼耐藥及其可能的機(jī)制。
　　方法:
　　1、PC9/ER耐藥細(xì)胞系的建立及耐藥性的檢測(cè):利用低濃度厄洛替尼持續(xù)誘導(dǎo)PC9細(xì)胞6個(gè)月后，建立PC9耐厄洛替尼細(xì)胞系PC9/ER，用CCK-8法檢測(cè)PC9/ER的耐藥性。
　　2、OCT對(duì)PC9/ER細(xì)胞的改善耐藥作用:用CCK-8法檢測(cè)OCT、厄洛替尼+OCT對(duì)

5、PC9細(xì)胞及PC9/ER細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)照組、OCT、厄洛替尼及厄洛替尼+OCT作用于PC9/ER后細(xì)胞凋亡變化。
　　3、OCT對(duì)PC9/ER細(xì)胞的改善耐藥機(jī)制探討:以厄洛替尼（1μmol/L）和OCT（10μmol/L）單獨(dú)或聯(lián)合作用PC9/ER細(xì)胞48h，并以常規(guī)培養(yǎng)的PC9/ER細(xì)胞做對(duì)照，Western bolt檢測(cè)IGF-1R、p-IGF-1R、Akt和p-Akt表達(dá)變化;qRT-PCR檢測(cè)OCT作用P

6、C9/ER細(xì)胞后IGF-1、IGF-1RmRNA表達(dá)變化;ELISA檢測(cè)OCT作用PC9/ER后細(xì)胞上清IGF-1的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1、通過0.1μmol/L厄洛替尼誘導(dǎo)PC9細(xì)胞6個(gè)月后，用CCK-8檢測(cè)耐藥指數(shù)，厄洛替尼對(duì)PC9、PC9/ER細(xì)胞的IC50分別為4.809μmol/L(PC9/ER)和0.4608μmol/L(PC9)，耐藥指數(shù)為10.43，成功建立了耐厄洛替尼PC9/ER細(xì)胞。與親本PC9細(xì)

7、胞相比，PC9/ER中IGF-1R、p-IGF-1R、Akt、p-Akt在蛋白水平升高。
　　2、厄洛替尼聯(lián)合OCT能改善PC9/ER細(xì)胞耐藥，單用厄洛替尼和聯(lián)和OCT作用PC9/ER細(xì)胞后的IC50分別為4.809μmol/L和0.4998μmol/L，改善倍數(shù)為9.62倍。聯(lián)合用藥后PC9/ER細(xì)胞的IGF-1R、p-IGF-1R、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)均降低。
　　3、OCT作用于PC9/ER細(xì)胞后，IGF-1R、

8、IGF-1 mRNA水平均表達(dá)下調(diào)。
　　4、厄洛替尼聯(lián)合OCT能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，和單用厄洛替尼、OCT組相比，作用48h后，聯(lián)合用藥組凋亡率增加。
　　結(jié)論:
　　1.成功建立了對(duì)厄洛替尼耐藥的PC9/ER細(xì)胞、且能穩(wěn)定傳代。
　　2.IGF-1R高表達(dá)是PC9/ER細(xì)胞對(duì)厄洛替尼耐藥的機(jī)制之一。
　　3.OCT聯(lián)合厄洛替尼通過抑制PC9/ER細(xì)胞IGF-1的表達(dá)、分泌，抑制IGF-1R及其下游Akt活化而