替尼類藥物耐藥機(jī)制及NO供體型化合物克服腫瘤耐藥研究.pdf

1、背景：癌癥是威脅人類健康的第一殺手，而化療是癌癥治療的重要手段，在臨床治療中由于多藥耐藥(Multidrug resistance，MDR)的出現(xiàn)，造成化療的失敗。因此，探究藥物產(chǎn)生耐藥性的原因和尋找有效的克服耐藥的藥物顯得尤為重要。眾所周知，人類多種常見癌癥中均有EGFR高表達(dá)，其中包括我國(guó)高發(fā)的肝癌，近年來(lái)分子靶向藥物EGFR-TKI開始試用于治療晚期肝癌，個(gè)別藥物取得了突破性進(jìn)展，但是其潛在的耐藥問題值得我們關(guān)注；最近有研究顯示N

2、O能克服經(jīng)典ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的耐藥。基于以上兩個(gè)方面，本研究旨在研究靶向EGFR的TKI艾洛替尼、吉非替尼和凡德他尼在肝癌HepG2細(xì)胞中潛在的耐藥機(jī)制，并對(duì)NO供體型化合物AB-19在克服耐藥腫瘤的活性和機(jī)制進(jìn)行評(píng)價(jià)研究。
　　 1.替尼類藥物耐藥機(jī)制
　　 目的：體外建立人肝癌艾洛替尼、吉非替尼和凡德他尼耐藥的細(xì)胞株HepG2/Erlotinib、HepG2/Gefitinib和HepG2/Vandatinib，鑒

3、定其生物學(xué)特性，并對(duì)其耐藥機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　 方法：以逐步遞增聯(lián)合大劑量藥物沖擊方法，在體外連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞HepG2，建立替尼類藥物耐藥的細(xì)胞株HepG2/Erlotinib、HepG2/Gefitinib和HepG2/Vandatinib。以SRB法測(cè)定其耐藥倍數(shù)和耐藥譜，測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線并計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其細(xì)胞周期，以RT-PCR和Westernblot方法檢測(cè)耐藥細(xì)胞中耐藥基因bcrp基因

4、及其蛋白BCRP的表達(dá)，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面BCRP蛋白表達(dá)，并用基因芯片和雙向電泳對(duì)耐藥細(xì)胞HepG2/Gefitinib和敏感細(xì)胞HepG2進(jìn)行鑒定，對(duì)其耐藥機(jī)制進(jìn)行研究。
　　 結(jié)果：成功建立了人肝癌細(xì)胞靶向藥物EGFR-TKI的耐藥細(xì)胞株HepG2/Erlotimb、HepG2/Gefitinib和HepG2/Vandatinib，它們產(chǎn)生了原藥4-10倍的低倍耐藥，其對(duì)順鉑、紫杉醇、阿霉素、米托葸醌和拓泊替康有交叉

5、耐藥性，而HepG2/Erlotinib對(duì)紫杉醇保持敏感；耐藥細(xì)胞倍增時(shí)間變長(zhǎng)，流式細(xì)胞分析表明耐藥細(xì)胞比敏感細(xì)胞S期和G2/M期比例增高，G0/G1期比例減少，經(jīng)過RT-PCR，Western blot和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，耐藥細(xì)胞中bcrp基因和BCRP蛋白表達(dá)升高，對(duì)耐藥細(xì)胞HepG2/Gefitinib和敏感細(xì)胞HepG2的基因芯片和雙向電泳結(jié)果顯示耐藥細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生可能與上調(diào)的基因或蛋白有關(guān)，深入的機(jī)制研究還在進(jìn)行中。
　

6、　 結(jié)論：建立的人替尼類藥物耐藥的細(xì)胞株HepG2/Erlotinib、HepG2/Gefitinib和HepG2/Vandatinib具有耐藥細(xì)胞的特征和生物學(xué)特性，其耐藥機(jī)制與細(xì)胞中BCRP蛋白的上調(diào)有關(guān)，也可能與鑒定出來(lái)差異基因或蛋白相關(guān)。
　　 2.NO供體型化合物克服腫瘤耐藥研究
　　 目的：研究NO供體型化合物AB-19對(duì)經(jīng)典耐藥相關(guān)蛋白介導(dǎo)的耐藥和相應(yīng)敏感細(xì)胞的細(xì)胞毒性，以及克服腫瘤耐藥的機(jī)制。
　

7、　 方法：采用MTS和SRB法測(cè)定對(duì)耐藥及敏感細(xì)胞(HEK93/BCRP、HEK293/MRP1和HEK293/vector，K562/A02和K562)以及肝癌細(xì)胞與正常肝細(xì)胞的(HepG2和L02)的細(xì)胞毒性；應(yīng)用NO檢測(cè)試劑盒測(cè)定NO釋放與活性的關(guān)系，并考察加入NO清除劑(Hemoglobin)后對(duì)抗腫瘤活性的影響；采用FACS檢測(cè)AB-19對(duì)P-gp，BCRP逆轉(zhuǎn)功能影響；Western blot檢測(cè)AB-19對(duì)P-gp，BC

8、RP及相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行檢測(cè)。
　　 結(jié)論：NO供體型化合物AB-19對(duì)耐藥和敏感細(xì)胞具有較強(qiáng)的、相似的細(xì)胞毒作用，對(duì)肝癌細(xì)胞毒性大于正常肝細(xì)胞；對(duì)MDR-ABC耐藥相關(guān)蛋白BCRP，P-gp沒有逆轉(zhuǎn)、降解和增敏作用；機(jī)制研究表明，AB-19通過釋放高濃度NO來(lái)殺傷敏感/耐藥細(xì)胞，且對(duì)信號(hào)通路分子AKT、ERK、NF-κB無(wú)作用，而對(duì)p-AKT、P-ERK、p-NF-κB和HIF-1α有顯著作用，并呈時(shí)間和劑量依賴性，為克服耐藥腫