FOXM1-MET正反饋環(huán)路促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞吉非替尼耐藥的機(jī)制研究.pdf

1、吉非替尼耐藥限制了其臨床應(yīng)用，其機(jī)制丞待進(jìn)一步研究。近四分之一的EGFR-TKI耐藥患者被檢出 MET基因擴(kuò)增。MET基因擴(kuò)增已被證實(shí)是通過(guò)修復(fù)由ERBB3反式激活介導(dǎo)的PI3K/AKT等信號(hào)通路來(lái)獲得吉非替尼耐藥，是吉非替尼耐藥的重要機(jī)制。PI3K/AKT信號(hào)通路在肺癌細(xì)胞中常常過(guò)度激活，并與肺癌的演進(jìn)和EGFR-TKI耐藥密切相關(guān)。近期幾項(xiàng)研究表明，與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的促癌轉(zhuǎn)錄因子FOXM1在腫瘤細(xì)胞吉非替尼耐藥中發(fā)揮了重要作用，但

2、具體的分子機(jī)制尚不十分明確。此外，有研究表明FOXM1受PI3K/AKT信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。本課題調(diào)查了FOXM1在肺腺癌吉非替尼耐藥中的作用，并發(fā)現(xiàn)FOXM1和MET/AKT信號(hào)通路存在相互調(diào)節(jié)的分子機(jī)制。FOXM1在肺腺癌細(xì)胞中能與MET DNA啟動(dòng)子結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控 MET，MET也能在肺腺癌細(xì)胞中通過(guò)激活 PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子FOXM1。FOXM1與MET信號(hào)通路相互調(diào)節(jié)并形成一個(gè)正反饋環(huán)路促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞吉非替

3、尼耐藥。還發(fā)現(xiàn)FOXM1、MET和pAKT在肺腺癌組織中的表達(dá)遠(yuǎn)高于正常肺組織，且這三個(gè)分子在肺腺癌組織中的表達(dá)正相關(guān)。本課題不但闡明了FOXM1與MET/AKT信號(hào)通路在肺腺癌細(xì)胞中相互調(diào)節(jié)的分子機(jī)制，也為FOXM1作為肺腺癌治療靶點(diǎn)提供更為豐富的理論基礎(chǔ)。
　　第一部分FOXM1促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞吉非替尼耐藥的作用研究
　　為建立肺腺癌吉非替尼耐藥細(xì)胞系，采用逐漸增加細(xì)胞培養(yǎng)基吉非替尼濃度的方法誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞的產(chǎn)生，6個(gè)月后成

4、功建立了吉非替尼耐藥細(xì)胞系PC9/GR和HCC827/GR。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，上調(diào)FOXM1能顯著增強(qiáng)PC9和HCC827細(xì)胞的吉非替尼耐藥能力，而下調(diào)FOXM1能顯著降低PC9/GR和HCC827/GR細(xì)胞的吉非替尼耐藥能力。EdU檢測(cè)結(jié)果顯示，上調(diào)FOXM1使吉非替尼作用后的EdU陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，而下調(diào)FOXM1使吉非替尼作用后的EdU陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少。此外，上調(diào)FOXM1能明顯抑制吉非替尼對(duì)PC9和HCC827細(xì)胞的凋亡和G1

5、期阻滯作用，而下調(diào)FOXM1能明顯促進(jìn)吉非替尼對(duì)PC9/GR和HCC827/GR細(xì)胞的凋亡和G1期阻滯作用。這些結(jié)果說(shuō)明 FOXM1在肺腺癌吉非替尼耐藥中發(fā)揮了重要作用，能減弱吉非替尼對(duì)肺腺癌細(xì)胞的凋亡和G1期阻滯作用。
　　第二部分FOXM1在肺腺癌細(xì)胞中激活MET/AKT信號(hào)通路的機(jī)制研究
　　采用蛋白質(zhì)免疫印跡法和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR法在蛋白和 mRNA水平觀察FOXM1和相關(guān)分子在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)FOXM

6、1、pMET、MET和pAKT在肺腺癌吉非替尼耐藥細(xì)胞系PC9/GR和HCC827/GR中的表達(dá)遠(yuǎn)高于其親代細(xì)胞系PC9和HCC827。此外，在PC9/GR和HCC827/GR細(xì)胞中下調(diào)FOXM1能顯著降低FOXM1、pMET、MET和pAKT的蛋白表達(dá)水平，且能降低MET的mRNA表達(dá)水平。在PC9和HCC827細(xì)胞中上調(diào)FOXM1能顯著升高FOXM1、pMET、MET和pAKT的蛋白表達(dá)水平，且能升高 MET的 mRNA表達(dá)水平，但

7、 MET抑制劑PHA-665752具有一定的逆轉(zhuǎn)作用。為進(jìn)一步明確FOXM1調(diào)控MET的分子機(jī)制，采用ChIP結(jié)合PCR的方法發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子FOXM1在肺腺癌細(xì)胞PC9和HCC827中能與MET的DNA啟動(dòng)子結(jié)合。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)OXM1在肺腺癌細(xì)胞PC9和HCC827中能顯著增強(qiáng)MET的DNA啟動(dòng)子活性。通過(guò)荷瘤小鼠模型，在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證了FOXM1促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞吉非替尼耐藥的作用以及對(duì)MET信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。這些結(jié)果

8、說(shuō)明 FOXM1在肺腺癌細(xì)胞中能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控MET，并調(diào)控其下游AKT信號(hào)通路。
　　第三部分MET在肺腺癌細(xì)胞中激活A(yù)KT/FOXM1信號(hào)通路的機(jī)制研究
　　為進(jìn)一步明確FOXM1和MET信號(hào)通路的調(diào)控關(guān)系，在肺腺癌細(xì)胞中檢測(cè)了 MET/AKT信號(hào)通路對(duì) FOXM1的作用。在 PC9/GR和 HCC827/GR細(xì)胞中下調(diào)MET能顯著降低FOXM1、pMET、MET和pAKT的蛋白表達(dá)水平，且能降低FOXM1的mRNA表達(dá)

9、水平。在PC9和HCC827細(xì)胞中上調(diào)MET能顯著升高FOXM1、pMET、MET和pAKT的蛋白表達(dá)水平，且能升高FOXM1的mRNA表達(dá)水平，但AKT抑制劑LY294002具有一定的逆轉(zhuǎn)作用。此外，我們還發(fā)現(xiàn)FOXM1、MET和pAKT在肺腺癌組織中的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于相應(yīng)的癌旁正常肺組織，且這三個(gè)分子在肺腺癌組織中的表達(dá)正相關(guān)。這些結(jié)果說(shuō)明 MET/AKT信號(hào)通路在肺腺癌細(xì)胞中能調(diào)控FOXM1，F(xiàn)OXM1與MET/AKT信號(hào)通路相互調(diào)