多西他賽與吉非替尼不同時(shí)序應(yīng)用對(duì)人肺腺癌細(xì)胞的作用.pdf

1、研究背景和目的：
　　 肺癌是當(dāng)今世界上對(duì)人類健康與生命危害最大的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在全球惡性腫瘤中居首位，全世界每年肺癌發(fā)生超過(guò)150萬(wàn)例。其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC，non-smallcelllungcancer)約占肺癌的80％，30％-40％的NSCLC在診斷時(shí)已失去手術(shù)根治的機(jī)會(huì)[1]。化療是晚期NSCLC的主要治療手段，含鉑兩藥方案化療是目前晚期NSCLC一線治療的標(biāo)準(zhǔn)方案，但無(wú)論化療藥物如何組合，經(jīng)化療的

2、晚期NSCLC患者中位生存期約為8至10個(gè)月左右，一年生存率在30％-40％左右，其療效似乎已經(jīng)達(dá)平臺(tái)。
　　 近年來(lái)，隨著腫瘤分子生物學(xué)，腫瘤免疫學(xué)以及細(xì)胞生物學(xué)學(xué)科的迅猛發(fā)展，分子靶向治療應(yīng)運(yùn)而生。分子靶向治療針對(duì)細(xì)胞內(nèi)或表面特定分子，特異性強(qiáng)，不良反應(yīng)少，是目前腫瘤治療的一個(gè)研究熱點(diǎn)。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是受體ErbB家族的一員，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，提高腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、黏著和侵襲能力，從而增加腫瘤

3、向周邊及遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)，有研究表明EGFR的高表達(dá)與肺癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[2]。吉非替尼是2003年首個(gè)獲美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)用于既往化療失敗的晚期NSCLC治療的口服EGFR酪氨酸激酶抑制劑（Gefitinib，ZD1839，Iressa,易瑞沙）。兩項(xiàng)隨機(jī)、Ⅱ期臨床試驗(yàn)IDEAL1&2研究顯示，對(duì)于化療后復(fù)發(fā)的晚期NSCLC，吉非替尼可作為二線或三線治療，不良反應(yīng)輕，耐受性好，可長(zhǎng)期使用[3,4]。IPASS[5

4、]研究將吉非替尼作為一線治療與一線化療進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示，吉非替尼一線治療無(wú)進(jìn)展生存(PFS)顯著優(yōu)于TP聯(lián)合化療，最終OS數(shù)據(jù)無(wú)顯著差異(18.8個(gè)月vs.17.4個(gè)月)。隨后的三期臨床試驗(yàn)NEJGSG002和WJTOG3405研究表明對(duì)于EGFR基因突變的晚期NSCLC，吉非替尼PFS優(yōu)于化療，有延長(zhǎng)總生存的趨勢(shì)[6,7]。吉非替尼于2011年被FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于EGFR基因突變晚期非小細(xì)胞肺癌患者的一線治療。
　　 考慮到化

5、療藥物與EGFR-TKIs作用機(jī)制不同，人們寄希望于吉非替尼聯(lián)合化療能使晚期NSCLC療效提高。目前體外研究表明，吉非替尼與傳統(tǒng)化療藥物合用（包括順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、紫杉醇、多西他賽、多柔比星等）可以增強(qiáng)這些化療藥物抑制癌細(xì)胞增殖的效果，提示吉非替尼在體外具有協(xié)同化療藥物抗癌的作用，并且這一結(jié)果在動(dòng)物試驗(yàn)中得以證實(shí)[8]。但多個(gè)大型臨床研究INTACT1（健擇/順鉑聯(lián)合吉非替尼）[9]、INTACT2（紫杉醇/卡鉑聯(lián)合吉非替尼）[10

6、]和TRIBUTE（紫杉醇/卡鉑聯(lián)合厄羅替尼）[11]、TALENT（吉西他濱/順鉑聯(lián)合厄羅替尼）[12]均顯示EGFR-TKIs與化療同時(shí)作用在有效率及生存期方面并未優(yōu)于單獨(dú)化療，且不能提高無(wú)疾病進(jìn)展時(shí)間和疾病控制率。這種實(shí)驗(yàn)室研究與臨床研究不符的結(jié)果，引發(fā)了兩個(gè)問(wèn)題:(1)EGFR-TKIs與化療聯(lián)合使用是否存在“優(yōu)勢(shì)人群”。(2)EGFR-TKIs與化療的聯(lián)合使用的最佳方式是如何。(3)假設(shè)EGFR-TKIs與化療存在最佳給藥方式

7、，那么其細(xì)胞學(xué)機(jī)制是如何。因此，本研究的第一個(gè)目的是通過(guò)觀察多西他賽和吉非替尼不同順序用藥對(duì)EGFR野生型和EGFR突變型細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，尋找NSCLC細(xì)胞不同EGFR突變狀況的最佳給藥方式。
　　 化療與EGFR-TKIs二者聯(lián)合應(yīng)用增效與否的細(xì)胞學(xué)機(jī)制不明。既往的研究顯示，化療同時(shí)應(yīng)用EGFR-TKIs不增效的發(fā)生機(jī)制可能與細(xì)胞周期有關(guān)[13,14]，化療后序貫應(yīng)用EGFR-TKIs產(chǎn)生協(xié)同增效作用可能與EGFR磷酸化有關(guān)[

8、15]。近年的研究表明IGF-1R亦可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白PI3K/AKT影響細(xì)胞對(duì)化療及EGFR-TKIs敏感性[16，17]。因此，本研究的第二個(gè)目的旨在通過(guò)觀測(cè)多西他賽與吉非替尼不同時(shí)序應(yīng)用對(duì)EGFR野生型及突變型肺腺癌細(xì)胞的EGFR、IGF-1R表達(dá)及磷酸化影響、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白ERK、AKT表達(dá)及磷酸化影響及細(xì)胞周期變化，尋找可能的細(xì)胞學(xué)機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、高分辨率溶解曲線分析技術(shù)（Quantitati

9、vePCRhigh-resolutionmelting，qPCR-HRM）檢測(cè)A549及PC-9細(xì)胞EGFR及Kras基因突變;四甲基偶氮哇鹽(MTT)比色法檢測(cè)兩株細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，多西他賽與吉非替尼單藥及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)兩株細(xì)胞的生長(zhǎng)作用;Westernblotting檢測(cè)細(xì)胞信號(hào)蛋白的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化
　　 2、統(tǒng)計(jì)方法
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件進(jìn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表

10、示，相關(guān)各組間采用One-wayANOVA檢驗(yàn)，不同組間比較采用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05判斷為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、細(xì)胞EGFR和K-ras基因狀況
　　 A549細(xì)胞的EGFR基因無(wú)突變，K-ras基因第2外顯子為突變型;PC-9細(xì)胞的EGFR基因第19外顯子突變，K-ras基因無(wú)突變。
　　 2、多西他賽與吉非替尼對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響
　　 正常培養(yǎng)的兩株肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)均呈無(wú)

11、限繁殖，A549細(xì)胞第2天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，PC-9細(xì)胞第3天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。多西他賽(10-4M-10-10M)和吉非替尼(A549為10-2M-10-8M;PC-9為10-4M-10-10M)呈濃度依賴性抑制A549和PC-9細(xì)胞生長(zhǎng)。多西他賽和吉非替尼作用72h抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)的IC50值分別為5.24×10-7mol/L和1.28×10-5mol/L，抑制PC-9細(xì)胞生長(zhǎng)的IC50值分別為2.13×10-8mol/L和4.58

12、×10-8mol/L。吉非替尼抑制PC-9細(xì)胞生長(zhǎng)的作用明顯強(qiáng)于A549(P＜0.05)，兩株細(xì)胞相差近1000倍。
　　 多西他賽序貫吉非替尼對(duì)兩株細(xì)胞生長(zhǎng)抑制均具顯著增效作用，對(duì)A549及PC-9抑制增效率分別為9.34％(P＜0.05)和8.94％(P＜0.05)，但同時(shí)用藥只對(duì)PC-9細(xì)胞具增效作用（增效7.56％,P＜0.05）。
　　 3.多西他賽與吉非替尼不同時(shí)序應(yīng)用對(duì)細(xì)胞信號(hào)蛋白的影響
　　 IC

13、50濃度的多西他賽和吉非替尼分別增強(qiáng)和抑制兩株細(xì)胞EGFR和ERK磷酸化、均抑制PC-9細(xì)胞IGF-1R磷酸化。多西他賽誘導(dǎo)的EGFR和ERK磷酸化顯著被序貫應(yīng)用的吉非替尼抑制。兩藥同時(shí)應(yīng)用對(duì)抑制PC-9細(xì)胞的IGF-1R磷酸化具增強(qiáng)作用。
　　 4.多西他賽與吉非替尼同時(shí)及序貫應(yīng)用對(duì)細(xì)胞周期的影響
　　 多西他賽將A549及PC-9細(xì)胞阻滯在G2期（分別增加43.28％和30.13％，P＜0.05）。吉非替尼對(duì)A549

14、無(wú)明顯的G1期阻滯作用，但將PC-9細(xì)胞明顯阻滯在G1期（增加29.98％，P＜0.05）。多西他賽序貫吉非替尼組將兩株細(xì)胞明顯阻滯在G2期，較對(duì)照組上升約54.11％和40.77％(P＜0.05)。同步組和吉非替尼序貫多西他賽組兩株細(xì)胞的各期細(xì)胞無(wú)明顯變化。
　　 結(jié)論：
　　 本研究發(fā)現(xiàn):
　　 1、人肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞為EGFR野生型;PC-9細(xì)胞為EGFR突變型。細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)顯示A549和PC-9細(xì)胞