吉非替尼通過(guò)自噬促進(jìn)人肺腺癌PC-9細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、自噬是一個(gè)普遍存在于真核細(xì)胞且高度保守的代謝過(guò)程,它是細(xì)胞自我更新,組織器官發(fā)育和分化的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。大量研究表明腫瘤細(xì)胞在缺氧、營(yíng)養(yǎng)缺乏、細(xì)胞器受損等刺激下可以發(fā)生自噬。適度的自噬可以維持腫瘤細(xì)胞物質(zhì)代謝和能量供給,保護(hù)腫瘤細(xì)胞在不利環(huán)境中繼續(xù)生存,而過(guò)度自噬則導(dǎo)致重要蛋白質(zhì)和細(xì)胞器受損,細(xì)胞進(jìn)而發(fā)生凋亡或者壞死。由此可見(jiàn)自噬對(duì)于腫瘤細(xì)胞是一把雙刃劍,其最終作用可能與腫瘤細(xì)胞組織來(lái)源和受到的刺激因素有關(guān)。調(diào)控細(xì)胞自噬,發(fā)揮自噬殺傷腫瘤

2、細(xì)胞作用可能用于腫瘤個(gè)體化治療。本實(shí)驗(yàn)以EGFR突變型人肺腺癌PC-9細(xì)胞為研究對(duì)象,觀察EGFR分子靶向藥物吉非替尼(Gefitinib)誘導(dǎo)PC-9細(xì)胞凋亡和自噬的作用及相關(guān)機(jī)制。
　　第一部分:通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定PC-9細(xì)胞Gefitinib IC50;Annexin V-FITC/PI雙重染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Gefitinib誘導(dǎo)PC-9細(xì)胞凋亡的作用。
　　第二部分:綜合采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)研究手段,觀察Gefi

3、tinib誘導(dǎo)PC-9細(xì)胞自噬的作用。吖啶橙(AO)染色發(fā)現(xiàn)PC-9細(xì)胞經(jīng)Gefitinib處理后,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅染的嗜酸性自噬囊泡(AVOs);細(xì)胞轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒,激光共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)Gefitinib處理后細(xì)胞內(nèi)綠色熒光點(diǎn)狀聚集;透射電鏡下可以觀察到典型自噬小體,確定Gefitinib可以誘發(fā)PC-9細(xì)胞自噬。Western blot檢測(cè)自噬標(biāo)記物L(fēng)C3表達(dá),結(jié)果顯示Gefitinib促進(jìn)LC3 I→LC3 II轉(zhuǎn)化,升

4、高LC3-II/I比值。
　　第三部分:主要進(jìn)行Gefitinib誘發(fā)PC-9細(xì)胞自噬的功能研究。使用自噬強(qiáng)效誘導(dǎo)劑雷帕霉素(Rapamycin)聯(lián)合Gefitinib處理PC-9細(xì)胞,細(xì)胞凋亡率明顯增加,p-mTOR和p-Akt表達(dá)進(jìn)一步受到抑制;使用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)阻斷Gefitinib誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬,PC-9細(xì)胞凋亡率較Gefitinib單藥處理組減少,p-mTOR和p-Akt不能被有效抑制;說(shuō)明Gefi