系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)分子OAS1的表達(dá)純化、活性檢測及其參與RNA干擾的初探.pdf

1、I 型干擾素及其誘導(dǎo)的信號(hào)通路和相關(guān)蛋白是SLE 新的致病通路。2’-5’寡腺苷酸合成酶（2’-5’oligoadenylate synthetase，OAS）為干擾素誘導(dǎo)下高表達(dá)豐度的基因之一，傳統(tǒng)被認(rèn)為是具備抗病毒特性的活性蛋白質(zhì)。既往對(duì)SLE患者基因表達(dá)譜的研究中發(fā)現(xiàn)OAS1基因較正常人群存在突出的高表達(dá)且與疾病活動(dòng)度相關(guān)，但其在SLE 疾病活動(dòng)和在SLE發(fā)病機(jī)制中究竟發(fā)揮了什么作用，目前尚不清楚。 目的：已知OAS的活化

2、是雙鏈核糖核酸(dsRNA)依賴的。通常認(rèn)為，該dsRNA為各種病毒復(fù)制過程中的中間產(chǎn)物，OAS的活化又進(jìn)一步激活Rnasel，從而降解病毒的單鏈RNA。同時(shí)又有證據(jù)表明，OAS 可以抑制宿主細(xì)胞的增殖。我們?cè)诒狙芯恐刑岢黾僬f：OAS 可能參與了機(jī)體自身的RNA 干擾（RNA interference，RNAi），導(dǎo)致某些參與免疫調(diào)控、免疫耐受基因的沉默，從而參與了SLE的發(fā)病。 方法：1. 在原核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并純化OAS1蛋白。

3、pET-9d-OAS1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，摸索適宜的誘導(dǎo)溫度，誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度，表達(dá)HIS-OAS1 融合蛋白。利用融合蛋白的組氨酸標(biāo)簽、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和蛋白質(zhì)分子量等理化特性，采取親和層析，陽離子交換層析和分子篩凝膠層析技術(shù)得到高純度的目的蛋白質(zhì)，使用免疫印跡法鑒定HIS-OAS1 融合蛋白。 2. 125I 標(biāo)記的放射免疫法測定不同樣本中的寡腺苷酸（2-5A）濃度，反映不同樣本中OAS的活性水平。收集處于疾病

4、活動(dòng)期和穩(wěn)定期的SLE患者血清，活動(dòng)性RA患者血清，HBV 感染患者血清以及正常人血清；測定其中125I 標(biāo)記的2-5A 水平，研究OAS1蛋白活性水平在各組間差異性和與SLE 疾病活動(dòng)性之間的關(guān)系。同時(shí)對(duì)純化的HIS-OAS1 融合蛋白進(jìn)行活性檢測。 3.使用體外蛋白質(zhì)-核酸相互作用的方法捕捉SLE患者體內(nèi)可能與OAS1 結(jié)合的sRNA。從SLE 活動(dòng)期患者外周血中抽提RNA，與吸附在NI2+瓊脂糖介質(zhì)上的OAS1 融合蛋白反

5、應(yīng)，將捕獲的目的核酸片段擴(kuò)增后測序并鑒定核酸來源。 結(jié)果：1.通過對(duì)誘導(dǎo)條件的摸索，成功表達(dá)HIS-OAS1 融合蛋白，經(jīng)層析技術(shù)純化得到高純度的HIS-OAS1 融合蛋白。 2. 經(jīng)125I 標(biāo)記的放射免疫法測定，SLE患者血清中OAS 活性顯著高于正常人，活動(dòng)期RA患者，HBV 感染患者，尤其以處于疾病活動(dòng)期者為甚，后者與穩(wěn)定組之間的差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；顒?dòng)性RA組和HBV 感染組以及正常對(duì)照組之間均無顯著差異。同時(shí)

6、檢測原核表達(dá)的HIS-OAS1 融合蛋白，提示融合蛋白具有催化生成2-5A的活性。 3.使用HIS-OAS1 融合蛋白捕捉到SLE患者體內(nèi)與OAS1 相互作用的sRNA，經(jīng)與microRNA 庫比照，提示序列與人microRNA105，人microRNA604，人microRNA640 高度一致，可能與OAS1 存在相互作用，該結(jié)果尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。 結(jié)論：本研究中，我們?cè)谠思?xì)胞中表達(dá)并純化了OAS1蛋白，得到了高純度的