系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)lncRNA的篩選及功能初探.pdf

1、第一部分、長(zhǎng)鏈非編碼R NA在狼瘡小鼠模型的篩選和功能初探
　　目的：系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種系統(tǒng)性自身免疫性疾病，被公認(rèn)是自身免疫病的原型，其發(fā)病與Ⅰ型干擾素通路過(guò)度活化及固有免疫應(yīng)答異常密切相關(guān)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）是真核細(xì)胞中一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200nt的非編碼RNA分子，通常不具有蛋白編碼功能，在哺乳動(dòng)物基因組普遍被轉(zhuǎn)錄。最新的研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs能夠在多個(gè)水

2、平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而在免疫系統(tǒng)各個(gè)方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本研究旨在篩選SLE小鼠模型中異常表達(dá)的lncRNA基因，尋找與SLE有相關(guān)性的lncRNA，初步探索其在疾病中的功能及可能的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)狼瘡小鼠與對(duì)照組4個(gè)lncRNA（lincRNA-cox2，Gm16638，Gm17280，Gm17726）的差異性表達(dá)；通過(guò)磁珠分選MRL/lpr小鼠脾臟CD4

3、+T細(xì)胞，測(cè)定lncRNA在特異性免疫細(xì)胞的表達(dá)差異。
　　2.Raw細(xì)胞和3T3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA下調(diào)lincRNA-cox2后，利用RT-qPCR和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）分別檢測(cè)下游靶基因在mRNA水平和蛋白的變化。
　　3.利用熒光報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)lincRNA-cox2下調(diào)后對(duì)I型干擾素通路中ISR E報(bào)告基因的影響。
　　4.采用Western-blot檢測(cè)下調(diào)lincRNA-cox2后對(duì)I型干擾素

4、通路中轉(zhuǎn)錄因子的影響。
　　5.使用IFN-α和IFN-γ等刺激劑研究lincRNA-cox2的表達(dá)調(diào)控。
　　結(jié)果：
　　1.4個(gè)lncRNA在狼瘡小鼠脾臟及骨髓組織的表達(dá)異常偏低，且在lpr小鼠CD4+ T細(xì)胞的表達(dá)異常偏低；
　　2.體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)下調(diào)lincRNA-cox2可以促進(jìn)type I IFN信號(hào)通路的活化；
　　3.下調(diào)lincRNA-cox2可以活化type I IFN通路轉(zhuǎn)錄因子p-ST

5、AT1,p-STAT2；
　　4.持續(xù)的type I IFN刺激負(fù)反饋誘導(dǎo)lincRNA-cox2的表達(dá)。
　　結(jié)論：lincRNA-cox2在SLE小鼠中呈現(xiàn)低表達(dá)，而下調(diào)lincRNA-cox2可促進(jìn)type I IFN信號(hào)的過(guò)度活化，可能參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病。lincRNA-cox2可能作為抑制type I IFN信號(hào)通路的lncRNA，為SLE的治療提供了潛在靶點(diǎn)。
　　第二部分、長(zhǎng)鏈非編碼RNA與系統(tǒng)性紅

6、斑狼瘡的臨床相關(guān)性研究
　　目的：越來(lái)越多的研究表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）能夠在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)蛋白編碼基因的表達(dá),從而廣泛地參與包括細(xì)胞分化、個(gè)體發(fā)育在內(nèi)的重要生命過(guò)程,其異常表達(dá)還與多種人類重大疾病的發(fā)生密切相關(guān)。但是，與系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA尚無(wú)研究。文獻(xiàn)報(bào)道5個(gè)lncRNA(ENST00000437190：linc7190，ENST00000500949:linc0949，ENST000005

7、00597:linc0597，ENST00000501992: linc1992及 ENST00000523995: linc3995)可被先天免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)，并可影響細(xì)胞因子腫瘤壞死因子(TNF-a)和白介素(IL-6)的表達(dá)。本研究通過(guò)檢測(cè)這5個(gè)lncRNA表達(dá)水平，以篩選狼瘡病人中異常表達(dá)的lncRNA，并了解其與狼瘡疾病活動(dòng)度，器官損害，臨床特點(diǎn)和治療反應(yīng)的關(guān)系，尋找可用于狼瘡診斷、疾病監(jiān)測(cè)和判斷預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。
　　

8、方法：門診收集102個(gè)系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）病人，54個(gè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）病人和76個(gè)健康志愿者的外周血單個(gè)核細(xì)胞，利用實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）方法檢測(cè)lincRNAs表達(dá)水平。利用SLE Disease Activity Index2000 scores(SLEDAI-2K)評(píng)估疾病活動(dòng)度，Systemic Lupus International Collaborating Clinics/American Colleg

9、e of Rheumatology(SLICC/ACR) Damage Index(SDI)評(píng)估臟器損害。分析lincRNA和疾病活動(dòng)度、臟器損害的相關(guān)性。
　　結(jié)果：系統(tǒng)性紅斑狼瘡組的linc7190，linc0949和linc0597表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組和疾病對(duì)照組（P<0.0001）。Linc0949和linc7190水平與SLEDAI-2K成負(fù)相關(guān)(linc0949：r=-0.329，P=0.0007；linc719

10、0：r=-0.352，P=0.0003)，與補(bǔ)體C3水平成正相關(guān)(linc0949：r=0.348，P=0.0003，linc7190：r=0.334，P=0.007)。臟器損害組的linc0949和linc7190表達(dá)水平較無(wú)臟器水平組明顯下降。狼瘡性腎炎組較無(wú)腎臟受累組linc0949和linc7190水平組明顯下降。Linc0949和linc7190表達(dá)水平隨病情改善而明顯升高。Linc0597表達(dá)量與疾病活動(dòng)度及臟器損害無(wú)明顯相