基于磁珠固相載體的時間分辨熒光免疫分析技術(shù)平臺的建立及臨床應(yīng)用.pdf

1、近年來在免疫檢測行業(yè)內(nèi)開發(fā)出的磁珠與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析及化學(xué)發(fā)光免疫分析相結(jié)合形成的磁珠酶聯(lián)免疫分析技術(shù)、磁珠化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，該技術(shù)已廣泛開展并應(yīng)用至臨床疾病檢測。據(jù)文獻(xiàn)報道和市場調(diào)研，目前市面上基于時間分辨熒光免疫分析技術(shù)的試劑依舊基于傳統(tǒng)的微孔板式免疫分析，并且在結(jié)合免疫磁珠和時間分辨熒光免疫分析技術(shù)應(yīng)用于臨床疾病標(biāo)志物分子檢測方面缺少全面而準(zhǔn)確的系統(tǒng)性研究。
　　鑒于此，本研究對基于磁珠新型載體的免疫分析平臺進(jìn)行全面而

2、準(zhǔn)確的臨床應(yīng)用評估。對血清中不同類型的蛋白分子（包括大分子抗原抗體、半抗原及小分子單價抗原）而采用不同的反應(yīng)模式進(jìn)行研究，根據(jù)待測物的性狀及檢測的具體條件而設(shè)計不同的檢測模式，包括雙抗體夾心法、雙抗原夾心法、競爭法等。本實驗采用乙型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis B surface antigen，HBsAg)及e抗原(Hepatitis B eantigen，HBeAg)、乙型肝炎病毒表面抗體(Antibody tohepati

3、tis B surface antigen，anti-HBs)、游離甲狀腺素(Free Thyroxine，F(xiàn)T4)三種在方法學(xué)上具有代表性的血清標(biāo)志物，分別對雙抗體夾心法、雙抗原夾心法以及競爭法三種不同的反應(yīng)模式進(jìn)行可行性分析。本課題實驗內(nèi)容主要分為三大部分:(1)采用雙抗體夾心反應(yīng)模式，研制HBsAg和HBeAg磁珠時間分辨熒光免疫分析試劑;(2)采用雙抗原夾心反應(yīng)模式，研制抗-HBs磁珠時間分辨熒光免疫分析試劑;(3)采用直接競爭

4、反應(yīng)模式，研制FT4磁珠時間分辨熒光免疫分析試劑。實驗設(shè)計上涵蓋:(1)摸索不同粒徑、不同化學(xué)基團(tuán)修飾的磁珠連接蛋白，選取合適的磁珠作為固相載體并且優(yōu)化連接工藝和鑭系稀土元素螯合物標(biāo)記蛋白;(2)反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化，并通過優(yōu)化的反應(yīng)體系對試劑的各項性能指標(biāo)作出全面而整體的評價，包括準(zhǔn)確度、分析靈敏度、檢測范圍、劑量-反應(yīng)曲線、特異性、精密度、抗干擾性和穩(wěn)定性分析;(3)用自制試劑與國外同類進(jìn)口診斷試劑進(jìn)行平行比對，評價其初步應(yīng)用于臨床

5、診斷的可行性。利用磁珠作為固相載體建立的時間分辨反應(yīng)體系所具有的快速、小樣品量、檢測范圍寬、高靈敏度、小型化等特點極大滿足臨床隨診檢測的需要，將使其具有更廣闊的臨床應(yīng)用前景。
　　實驗一研究結(jié)果:(1)自制HBsAg磁珠時間分辨熒光免疫分析試劑在最優(yōu)條件下，分析靈敏度為0.02 IU/mL，線性范圍達(dá)0.2～700 IU/mL。檢測國家參考品的實測濃度與期望濃度的比值在0.925～1.067之間，分析內(nèi)和分析間變異系數(shù)分別在為4.

6、7％～8.7％和3.8％～7.5％之間，符合試劑鑒定要求。將高濃度的HBeAg、HBcAg、 HCV、HIV、TP、RF陽性樣品用本試劑測定，無明顯交叉反應(yīng)。檢測質(zhì)控樣本時不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾。將自制HBsAg試劑與雅培公司化學(xué)發(fā)光試劑對399份血清樣本進(jìn)行平行比對實驗，臨床特異性和敏感性符合率均100％，經(jīng)配對計數(shù)資料卡方檢驗:McNemar檢驗結(jié)果P=1（雙側(cè)）;κ系數(shù)檢驗結(jié)果，κ=1，P=0.000，說明兩種方法吻

7、合度有統(tǒng)計學(xué)意義且較強(qiáng)。再將231份雙陽性血樣測定結(jié)果分別設(shè)為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)做線性相關(guān)分析，相關(guān)方程為:Y=1.182X-0.017，相關(guān)系數(shù)r=0.989，P＜0.001。經(jīng)上述統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果表明，兩種檢測方法吻合度有統(tǒng)計學(xué)意義，臨床血樣測值均具有顯著相關(guān)性。(2)自制HBeAg磁珠時間分辨熒光免疫分析試劑在最優(yōu)條件下，分析靈敏度為0.021 PEI U/mL，線性范圍達(dá)0.4～160 PEI U/mL。檢測國際參考品不同稀釋比例樣品

8、的實測濃度與期望濃度的比值在0.942～0.978之間，分析內(nèi)和分析間變異系數(shù)分別在為2.8％～4.3％和4.2％～6.0％之間，符合試劑鑒定要求。將高濃度的HBsAg、 HBcAg當(dāng)作樣品用本試劑測定，無明顯交叉反應(yīng)。檢測質(zhì)控樣本時不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾。將自制試劑與雅培公司的化學(xué)發(fā)光試劑對257份血清樣本進(jìn)行平行比對實驗，臨床特異性和敏感性符合率均分別為95.8％和98.9％，經(jīng)配對計數(shù)資料卡方檢驗:McNemar檢驗

9、結(jié)果P=1（雙側(cè)）;κ系數(shù)檢驗結(jié)果，κ=0.951，P=0.000，說明兩種方法吻合度有統(tǒng)計學(xué)意義且較強(qiáng)。再將184份雙陽性血樣測定結(jié)果分別設(shè)為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)做線性相關(guān)分析，相關(guān)方程為:Y=1.002X-0.333，相關(guān)系數(shù)r=0.974，P＜0.001。經(jīng)上述統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果表明，兩種檢測方法吻合度有統(tǒng)計學(xué)意義，臨床血樣測值均具有顯著相關(guān)性。
　　實驗二研究結(jié)果:自制抗-HBs磁珠時間分辨熒光免疫分析試劑在最優(yōu)條件下，分析靈敏度為

10、0.45 mIU/mL，線性范圍達(dá)2～600 mIU/mL。檢測自制參考品的實測濃度與期望濃度的比值在0.964～1.018之間，分析內(nèi)和分析間變異系數(shù)分別在為2.4％～4.3％和3.5％～5.0％之間，符合試劑鑒定要求。將高濃度的HBeAb、HBcAb當(dāng)作樣品用本試劑測定，無明顯交叉反應(yīng)。檢測質(zhì)控樣本時不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾。將自制試劑與雅培公司的化學(xué)發(fā)光試劑對269份血清樣本進(jìn)行平行比對實驗，臨床特異性和敏感性符合率均

11、分別為96.3％和98.1％，經(jīng)配對計數(shù)資料卡方檢驗:McNemar檢驗結(jié)果P=0.687（雙側(cè)）;κ系數(shù)檢驗結(jié)果，κ=0.932，P=0.000，說明兩種方法吻合度有統(tǒng)計學(xué)意義且較強(qiáng)。再將210份雙陽性血樣測定結(jié)果分別設(shè)為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)做線性相關(guān)分析，相關(guān)方程為: Y=0.934X+2.511，相關(guān)系數(shù)r=0.988，P＜0.001。經(jīng)上述統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果表明，兩種檢測方法吻合度有統(tǒng)計學(xué)意義，臨床血樣測值均具有顯著相關(guān)性。
　　實

12、驗三研究結(jié)果:自制FT4磁珠時間分辨熒光免疫分析試劑在最優(yōu)條件下，分析靈敏度為0.47 pmol/L，線性范圍達(dá)2～200 pmol/L。檢測自制參考品的實測濃度與期望濃度的比值在0.934～0.973之間，分析內(nèi)和分析間變異系數(shù)分別在為2.7％～4.3％和4.0％～7.0％之間，符合試劑鑒定要求。將高濃度的T3、FT3、rT3當(dāng)作樣品用本試劑測定，無明顯交叉反應(yīng)。檢測質(zhì)控樣本時不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾。自制試劑通過對240

13、份健康查體者血清FT4進(jìn)行分析，確定正常人參考值范圍為11.0～25.0 ng/mL。將自制試劑與雅培公司的化學(xué)發(fā)光試劑對202份血清樣本進(jìn)行平行比對實驗，經(jīng)配對卡方檢驗，符合率達(dá)到99.0％，血樣測定結(jié)果分別設(shè)為為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)做線性相關(guān)分析，相關(guān)方程為:Y=0.986X+0.037，相關(guān)系數(shù)r=0.980，P＜0.001。經(jīng)上述統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果表明，兩種檢測方法吻合度有統(tǒng)計學(xué)意義，臨床血樣測值均具有顯著相關(guān)性。
　　綜上所述，本

14、研究利用磁珠作為固相載體結(jié)合時間分辨免疫分析技術(shù)，成功研發(fā)出基于雙抗體夾心、雙抗原夾心及競爭法反應(yīng)模式的試劑，用于檢測人血清中HBsAg、 HBeAg、抗-HBs及FT4四種不同血清分析物。經(jīng)評價，磁珠時間分辨熒光免疫分析試劑的各項指標(biāo)（準(zhǔn)確度、靈敏度、精密度、特異性、抗干擾性等）均滿足臨床檢測試劑要求，與同類進(jìn)口試劑比較，其臨床特異性和敏感性均無顯著差異，線性相關(guān)分析具有顯著相關(guān)性。本文全面而準(zhǔn)確地系統(tǒng)性闡述了磁珠作為固相載體能夠提高