癌胚抗原及甲胎蛋白與游離絨毛膜促性腺激素雙標(biāo)記磁珠時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑的研制.pdf

1、本研究主要是利用磁珠作為包被抗體的固相載體并結(jié)合時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)，采用雙抗體夾心法研制出磁珠時(shí)間分辨檢測(cè)CEA的單標(biāo)記熒光免疫分析試劑和同時(shí)檢測(cè)AFP及Freeβ-hCG的雙標(biāo)記熒光免疫分析試劑。本課題實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要分為三大部分:1）、用不同粒徑、不同化學(xué)基團(tuán)修飾的磁珠連接抗體，選取合適的磁珠作為固相載體并且優(yōu)化連接工藝和鑭系稀土元素螯合物標(biāo)記抗體;2）、反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化，并通過(guò)優(yōu)化的反應(yīng)體系對(duì)試劑盒的各項(xiàng)性能指標(biāo)作出全面而整

2、體的分析，包括:準(zhǔn)確性、靈敏度、特異性、精密度、抗干擾性分析、穩(wěn)定性;3）、用自制試劑盒與國(guó)外同類的診斷試劑進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)其初步應(yīng)用于臨床檢測(cè)的可行性。
　　研究結(jié)果一顯示，自制的CEA磁珠時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑在最優(yōu)條件下，經(jīng)測(cè)定本試劑分析靈敏度為0.5 ng/mL，將抗原稀釋成不同濃度進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為1～1000 ng/mL。用本研發(fā)試劑對(duì)三個(gè)不同濃度自制的CEA質(zhì)控品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果本試劑的分析內(nèi)變異系數(shù)(C

3、V％)為2.722％～3.252％和分析間變異系數(shù)(CV％)為3.157％～3.765％?；厥章蕦?shí)驗(yàn)結(jié)果為90.1％～99.2％，符合試劑盒要求。將高濃度的AFP、CA125、癌抗原19-9(CA19-9)及人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)當(dāng)作樣品用本試劑測(cè)定，結(jié)果表明無(wú)明顯交叉反應(yīng)。檢測(cè)質(zhì)控樣本時(shí)不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾。試劑盒放置于37℃7天或4℃1年，各項(xiàng)性能指標(biāo)均符合要求，穩(wěn)定性較好。用

4、自制的試劑分別與PerkinElmer Wallac公司微孔板式TRFIA試劑盒和雅培公司的化學(xué)發(fā)光試劑盒同時(shí)對(duì)239份血清樣本進(jìn)行檢測(cè)。以自制試劑測(cè)定血樣的CEA濃度結(jié)果為橫坐標(biāo)，以PerkinElmer Wallac公司微孔板式TRFIA測(cè)定的濃度結(jié)果為縱坐標(biāo)做回歸分析，相關(guān)方程為:Y=1.049X+1.696，相關(guān)系數(shù)R2=0.970，P＜0.001。以自制試劑測(cè)定血樣的CEA濃度結(jié)果為橫坐標(biāo)，以雅培公司化學(xué)發(fā)光測(cè)定的CEA濃度結(jié)

5、果為縱坐標(biāo)做回歸分析，相關(guān)方程為:Y=0.873X-3.802，相關(guān)系數(shù)R2=0.951，P＜0.001。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果表明，本方法同PerkinElmer Wallac公司微孔板式TRFIA和羅氏電化學(xué)發(fā)光試劑盒臨床血樣測(cè)值均具有顯著相關(guān)性。
　　研究結(jié)果二顯示，自制的AFP及Freeβ-hCG雙標(biāo)記磁珠時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑在優(yōu)化的條件下，經(jīng)測(cè)定本試劑AFP分析靈敏度和標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍分別為0.05 ng/mL和0.1～7

6、50 ng/mL，F(xiàn)reeβ-HCG分析靈敏度和標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍分別為0.08 ng/mL和0.16～450 ng/mL。用本自制試劑對(duì)AFP及Freeβ-hCG質(zhì)控品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果AFP的分析內(nèi)變異系數(shù)為2.6％～5.1％和分析間變異系數(shù)為1.9％～5.1％，F(xiàn)ree-β-HCG的分析內(nèi)變異系數(shù)為4.1％～4.7％和分析間變異系數(shù)為4.7％～5.0％?；厥章蕦?shí)驗(yàn)96.0％～106.0％，符合試劑盒要求。將高濃度的CEA、CA125、C

7、A15-3、CA19-9、LH、FSH、TSH及hCG當(dāng)作樣品用本試劑測(cè)定，結(jié)果表明無(wú)明顯交叉反應(yīng)。檢測(cè)質(zhì)控樣本時(shí)不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾。試劑盒放置于37℃7天或4℃1年，各項(xiàng)性能指標(biāo)均符合要求，穩(wěn)定性較好。用自制的試劑和PerkinElmer Wallac公司微孔板式TRFIA試劑盒同時(shí)對(duì)444份孕中期血清樣本進(jìn)行檢測(cè)。以自制試劑盒測(cè)定血樣的濃度結(jié)果為橫坐標(biāo)，以PerkinElmer Wallac公司微孔板式TRFIA試

8、劑盒測(cè)定的濃度結(jié)果為縱坐標(biāo)做回歸分析，AFP相關(guān)方程為:Y=0.961X+1.554，相關(guān)系數(shù)R2=0.970，P＜0.001;Freeβ-hCG相關(guān)方程為:Y=1.044X-1.421，相關(guān)系數(shù)R2=0.966，P＜0.001。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果表明，本發(fā)明方法同PerkinElmer Wallac公司微孔板式TRFIA試劑盒具有顯著相關(guān)性。
　　綜上所述，本論文一方面初步闡明了本研究研制的CEA磁珠時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑、AF

9、P及Freeβ-hCG雙標(biāo)記磁珠時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑的各項(xiàng)指標(biāo)（準(zhǔn)確性、靈敏度、精密度、特異性等）均滿足臨床檢測(cè)試劑要求，臨床評(píng)測(cè)結(jié)果與進(jìn)口產(chǎn)品性能相近，有望通過(guò)優(yōu)化后應(yīng)用于生產(chǎn)，同時(shí)將進(jìn)一步開(kāi)發(fā)臨床疾病標(biāo)志物的試劑。另一方面初步闡明了利用磁珠作為固相載體應(yīng)用于時(shí)間分辨熒光免疫分析能夠提高檢測(cè)靈敏度，擴(kuò)大線性范圍，縮短分析時(shí)間，提高檢測(cè)效率等優(yōu)點(diǎn)，有望進(jìn)一步將其應(yīng)用到多元分析中，在臨床分子診斷和食品檢測(cè)等生物化學(xué)分析中具有非常重要的