人絨毛膜促性腺激素促進胎盤糖皮質激素屏障11β-HSD2表達的機制研究.pdf

1、適量的糖皮質激素對胎兒器官的發(fā)育和成熟起著重要作用,據(jù)此原理,臨床至今仍然將糖皮質激素作為促進早產(chǎn)兒肺成熟的首選藥物,這對于提高早產(chǎn)兒的存活率、降低新生兒濕肺的發(fā)生率等非常重要。但如果妊娠期胎兒暴露于過量的糖皮質激素則對胎兒不利,不僅可以導致胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩,而且增加胎兒成年后患高血壓、心腦血管疾病、糖尿病等代謝性疾病的幾率。目前,這些由孕期暴露于不良因素導致的成年疾病已引起國際學術界的高度重視,被稱之為“胎兒起源的成人疾病”(feta

2、loriginsofadultdisease,FOAD)。因此,妊娠期適量控制胎兒體內(nèi)糖皮質激素的量對優(yōu)生優(yōu)育有重要意義。妊娠期母體腎上腺分泌的糖皮質激素量隨孕期逐漸增加,而胎兒腎上腺主要以合成脫氫表雄酮(DHEA)為主,直到孕晚期才能合成糖皮質激素。孕期胎兒體內(nèi)的糖皮質激素濃度僅為母體側的十分之一,且主要來源于胎兒自身合成的糖皮質激素,因此胎兒需要一道糖皮質激素保護屏障。以往實驗已經(jīng)充分表明,擔任糖皮質激素保護屏障的是一種糖皮質激素的

3、代謝酶,即11B.羥基類固醇脫氫酶Ⅱ型(11β-HSD2),它主要在胎盤的合體滋養(yǎng)層細胞表達,其作用是將具有生物活性的糖皮質激素皮質醇(cortisol,F)脫氫氧化為沒有生物活性的17-羥-11-脫氫皮質酮(可的松,cortisone,E)。在其作用下,母體來源的皮質醇主要以17-羥-11-脫氫皮質酮的形式進入胎兒體內(nèi),從而保證胎兒在低糖皮質激素的環(huán)境中生長發(fā)育。動物實驗發(fā)現(xiàn),抑制胎盤11β-HSD2的功能將導致胎盤糖皮質激素屏障的削

4、弱,胎兒不僅出現(xiàn)宮內(nèi)發(fā)育遲緩,還出現(xiàn)下丘腦-垂體-腎上腺軸的變化,且成年后出現(xiàn)高血壓、血糖升高等代謝性疾病。這不僅進一步印證了11β-HSD2的胎盤糖皮質激素屏障功能,而且也提示了研究胎盤11β-HSD2表達調控的重要臨床意義。
　　我們以往的研究發(fā)現(xiàn),一氧化氮通過cGMP途徑下調胎盤11β-HSD2的表達和活性,而forskolin激活cAMP/PKA途徑則上調胎盤11β-HSD2的表達和活性。cAMP/PKA途徑對于維持胎盤糖

5、皮質激素屏障非常重要,但通過cAMP/PKA途徑上調胎盤cAMP/PKA表達的胎盤內(nèi)源性激素至今不清楚。因此我們試圖在胎盤分泌的激素中篩選一種通過cAMP/PKA途徑上調胎盤11β-HSD2的激素。在所有胎盤分泌的以cAMP為第二信使的激素中,我們發(fā)現(xiàn)絨毛膜促性腺激素(hCG)的分泌特點與胎盤11β-HSD2似乎有某種聯(lián)系。HCG是孕期維持妊娠的重要激素,它屬于糖蛋白家族,這一家族還包括促甲狀腺激素釋放激素(TSH)、黃體生成素(LH)

6、,由α和β兩個不同的亞基組成,其中α亞基為糖蛋白家族共有亞基,而β亞基為特異性亞基。介導hCG作用的受體對LH也有很高的親和力,因此稱之為hCG/H受體。hCG/LH受體的第二信使為cAMP,近期研究表明hCG不僅在孕早期對卵巢、胎盤有作用,而且在孕中晚期對胎盤、胎兒均有作用。HCG能促進胎兒腎上腺合成硫酸脫氫表雄激素(DHEAS),以提供給胎盤進一步合成雌激素。HCG能維持孕晚期子宮靜息狀態(tài),從而起到保胎作用。HCG還能促進胎盤血管生

7、成,促進胎盤植入,對孕期子宮動脈血管擴張也具有重要作用。妊娠6周后,合成hCG的細胞由細胞滋養(yǎng)層細胞轉變?yōu)楹象w滋養(yǎng)層細胞,并于妊娠第8-10周時其合成的hCG的量達到頂峰。而此時,胎盤合體滋養(yǎng)層的糖皮質激素屏障也己建立,其轉化皮質醇為可的松的能力也在第8-12周時達到高峰,提示胎盤合體滋養(yǎng)層分泌的hCG量與其表達的11β-HSD2量可能存在密切關系。無獨有偶,胎盤合成和表達的hCG與11β-HSD2之間的關系也同樣表現(xiàn)在妊娠晚期:雖然妊

8、娠晚期胎盤仍具有相當強的分泌hCG和轉化皮質醇為17-羥-11-脫氫皮質酮的能力,但于足月分娩前2周胎盤分泌的hCG量出現(xiàn)一定程度下降,而此時胎盤11β-HSD2的表達量也出現(xiàn)一定程度下降,這進一步提示胎盤分泌hCG的量與11β-HSD2的表達量存在一定的相關性。因此我們推測hCG很可能就是通過cAMP/PKA途徑促進胎盤11β-HSD2表達的內(nèi)源性激素。在上述推測被證明成立后,另一個問題隨即出現(xiàn)。有文獻報道糖皮質激素能促進胎盤11b-

9、HSD2表達,而以往研究還發(fā)現(xiàn)糖皮質激素能促進孕早期和孕晚期胎盤合體滋養(yǎng)層細胞hCG的合成和釋放,那么hCG是否參與介導糖皮質激素對胎盤11β-HSD2的上調作用呢?我們同樣對這一問題進行了探討。
　　我們采用改良Kliman法獲得胎盤滋養(yǎng)層細胞,通過體外細胞培養(yǎng),對胎盤合體滋養(yǎng)層細胞進行研究。我們的研究結果表明:hCG是通過cAMP/PKA途徑促進胎盤11β-HSD2表達的內(nèi)源性激素。而且hCG介導了糖皮質激素對11β-HSD2

10、的上調作用。我們的實驗首次證明了hCG對胎盤糖皮質激素屏障的作用,豐富了胎盤糖皮質激素屏障的調節(jié)機制,加深了我們對胎盤的理解,為臨床應用hCG保胎以及優(yōu)生優(yōu)育提供理論基礎。
　　研究內(nèi)容
　　我們的實驗主要對孕晚期胎盤合體滋養(yǎng)層細胞進行體外培養(yǎng),探討胎盤合體滋養(yǎng)層細胞糖皮質激素屏障11β-HSD2的調節(jié)機制。我們主要研究通過cAMP/PKA途徑上調胎盤合體滋養(yǎng)層細胞11β-HSD2的內(nèi)源性激素是什么?通過對胎盤分泌的眾多激素

11、的分析及實驗我們確定SCG能通過cAMP/PKA途徑上調胎盤合體滋養(yǎng)層細胞11β-HSD2。以往實驗發(fā)現(xiàn)糖皮質激素本身能上調胎盤合體滋養(yǎng)層細胞11β-HSD2的表達,我們推測hCG可能介導糖皮質激素對胎盤合體滋養(yǎng)層細胞11β-HSD2的上調作用。通過實驗我們進一步證實了hCG能介導糖皮質激素對胎盤合體滋養(yǎng)層細胞11β-HSD2的上調作用。
　　材料與方法
　　1、孕晚期胎盤合體滋養(yǎng)層細胞體外培養(yǎng)方法。取正常妊娠(不合并妊娠期

12、糖尿病、妊娠期高血壓等),足月妊娠(孕38周-40周),行擇期剖宮產(chǎn)的胎盤組織(50g左右),用改良Kliman酶消化法體外分離胎盤細胞滋養(yǎng)層細胞并進行體外培養(yǎng)。體外培養(yǎng)24-48小時后,胎盤細胞滋養(yǎng)層細胞自發(fā)融合形成合體滋養(yǎng)層細胞,即我們的研究對象。
　　2、對體外培養(yǎng)的胎盤合體滋養(yǎng)層細胞進行加藥處理。培養(yǎng)48h后,用PBS清洗細胞,換培養(yǎng)液,然后向合體滋養(yǎng)層細胞加入cAMP/PKA通路激動劑forskolin、阻斷劑。H89、

13、外源性hCG、hCG-Ab、F等實驗藥物后,培養(yǎng)12h或24h。隨后對細胞進行相應處理。
　　3、通過QT-RT-PCR、Westernblotting方法測定細胞內(nèi)某一基因的mRNA水平及蛋白水平表達。
　　4、通過顯微鏡觀察及蘇木精一伊紅染色方法(HE染色)對體外分離細胞的成分、合體滋養(yǎng)層細胞融合情況進行觀察。
　　5、通過酶聯(lián)免疫發(fā)光法對細胞培養(yǎng)液中的β-hCG濃度進行定量測定。
　　6、cAMP-GloT

14、MAssay試劑盒測定細胞內(nèi)cAMP的水平。
　　7、通過質粒轉染胎盤細胞滋養(yǎng)層細胞、測定轉染質粒的報告基因的熒光活性來分析外加因素對11β-HSD2啟動子水平的影響。
　　實驗結果
　　1、我們通過酶聯(lián)免疫發(fā)光法測定細胞培養(yǎng)液中細胞分泌的β-hCG濃度,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)48小時后細胞分泌的hCG濃度即達到高峰。HCG是胎盤滋養(yǎng)層細胞分化的重要指標,hCG分泌濃度達到高峰后即認為胎盤合體滋養(yǎng)層細胞分化完全。因此證明我們分離的胎

15、盤細胞滋養(yǎng)層細胞經(jīng)過48小時的體外培養(yǎng)后完全分化融合為胎盤合體滋養(yǎng)層細胞,可以作為研究對象。我們通過蘇木精-伊紅染色方法(HE染色法)以及顯微鏡觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)觀察到我們培養(yǎng)的合體滋養(yǎng)層細胞合體形成很好。我們分離的合體滋養(yǎng)層細胞純度高、活性好。
　　2、通過QT-RT-PCR、Westernblotting方法證明hCG能通過cAMP/PKA途徑上調胎盤合體滋養(yǎng)層細胞11β-HSD2的mRNA水平和蛋白水平表達。通過報告基因方法

16、我們發(fā)現(xiàn)forskolin、H89、hCG、hCG-Ab能相應影響11β-HSD2啟動子的轉錄水平。hCG-Ab能減少合體滋養(yǎng)層細胞內(nèi)cAMP水平,從而使11β-HSD2表達量下降。
　　3、通過QT-RT-PCR、Westernblotting方法證明糖皮質激素能上調胎盤合體滋養(yǎng)層細胞11β-HSD2的mRNA水平和蛋白水平表達,酶聯(lián)免疫發(fā)光法測定細胞培養(yǎng)液中β-hCG濃度表明糖皮質激素能促進胎盤合體滋養(yǎng)層細胞hCG的表達和釋放