地鱉纖溶活性蛋白基因克隆及轉(zhuǎn)染表達對S180細胞作用的研究.pdf

1、地鱉蟲是一種藥用歷史悠久的中藥材，通過現(xiàn)代生物提取技術(shù)，本實驗室從中提取出一種具有纖溶活性的蛋白酶，即地鱉纖溶蛋白。通過研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白不僅有很好的溶栓效果，同時對許多腫瘤細胞具有很好的抑瘤作用。深入研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白能夠抑制血管的生成，從而可截斷腫瘤細胞的營養(yǎng)來源，將腫瘤細胞“餓”死。本文采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將地鱉纖溶蛋白基因轉(zhuǎn)入s180細胞中，通過其表達，觀察是否對癌細胞生長有一定不利影響，以證明該蛋白的抑瘤作用。
　　 本實驗通過

2、參照實驗室調(diào)取的地鱉纖溶蛋白基因，選擇適宜載體克隆位點的酶切位點，設(shè)計適當?shù)囊?，通過提取地鱉總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈，PCR調(diào)取地鱉纖溶蛋白酶，然后通過TA克隆將地鱉纖溶蛋白基因連接到pM19上，通過藍白篩選，挑選陽性克隆，進行PCR驗證，再通過雙酶切，提取地鱉纖溶蛋白基因片段，構(gòu)建pCDNA3.1(+)-EFP轉(zhuǎn)染s180細胞，在G418篩選壓力下，篩選穩(wěn)定表達系細胞。同時觀察記錄細胞形態(tài)。提取穩(wěn)定表達系細胞的胞內(nèi)蛋白，做SD

3、S-PAGE，分析細胞內(nèi)蛋白的表達情況。
　　 通過實驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pCDNA3.1(+)-EFP質(zhì)粒載體的s180細胞，細胞由梭形變?yōu)閳A形，同時細胞粘附性降低，貼壁生長減弱，在細胞培養(yǎng)液內(nèi)出現(xiàn)絮狀“葡萄串樣”細胞簇。通過檢測發(fā)現(xiàn)地鱉纖溶蛋白能夠在s180細胞內(nèi)表達，導(dǎo)致上述現(xiàn)象的產(chǎn)生。說明地鱉蟲纖溶蛋白具有抗腫瘤細胞粘附侵潤，轉(zhuǎn)移等功效，同時表明地鱉纖溶蛋白基因可用來構(gòu)建抗腫瘤腫瘤基因治療的載體。但由于地鱉纖溶蛋白抗腫瘤的機制還