PPARα激動(dòng)劑調(diào)控心臟糜酶介導(dǎo)大鼠心肌纖維化的作用及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景及目的:心肌纖維化是高血壓左心室重構(gòu)的重要病理改變之一，也是心臟舒張功能障礙的主要原因，更是心功能由代償期向失代償期轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵。因此，預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌纖維化、恢復(fù)心功能對(duì)高血壓靶器官保護(hù)具有重要意義。大量研究表明，來(lái)源于心臟肥大細(xì)胞的糜酶參與心血管的病理性重構(gòu)，在高血壓、心肌梗死、心肌病、心力衰竭、冠脈支架植入術(shù)后再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化及動(dòng)脈瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。文獻(xiàn)報(bào)道，糜酶能抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)心肌細(xì)胞肥

2、大。心臟成纖維細(xì)胞(CFs)是心肌纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，其過(guò)度增殖及膠原合成增多是心肌纖維化的病理基礎(chǔ)。但糜酶對(duì)CFs增殖與膠原合成有何影響及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制目前尚不清楚。近年研究表明，糜酶能激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)的前體，但糜酶能否通過(guò)活化的TGF-β1誘導(dǎo)CFs增殖及膠原合成目前還不明確。Smads蛋白家族是近年發(fā)現(xiàn)的參與TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)分子之一，特異性地調(diào)節(jié)TGF-β1靶基因的表達(dá)。業(yè)已證實(shí)，TGF-β

3、1/Smads信號(hào)通路的激活參與肝、肺、腎、腹膜和皮膚等器官和組織的纖維化病變，但該信號(hào)通路是否在高血壓心肌纖維化的病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用尚不清楚。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是一類(lèi)配體依賴(lài)的核轉(zhuǎn)錄因子，包括α、β/δ和γ三種亞型。近年來(lái)關(guān)于PPARγ及其激動(dòng)劑噻唑烷二酮類(lèi)藥物在代謝綜合征中的心血管保護(hù)作用已進(jìn)行了廣泛研究，但對(duì)于PPARα的研究相對(duì)較少。晚近研究表明，PPARα在心肌組織呈高水平表達(dá)，對(duì)心肌肥厚發(fā)揮負(fù)調(diào)控作

4、用，這預(yù)示著PPARα信號(hào)通路將成為高血壓左心室肥厚防治新策略的一個(gè)有效靶點(diǎn)。貝特類(lèi)調(diào)脂藥對(duì)原發(fā)性高甘油三脂血癥有肯定的療效，自從被確認(rèn)為PPARα的特異性激動(dòng)劑以來(lái)，非諾貝特調(diào)脂以外的心血管保護(hù)效應(yīng)倍受關(guān)注。在體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，非諾貝特可抑制多種炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子引起的心肌細(xì)胞肥大，但其對(duì)CFs增殖與膠原合成有無(wú)影響及其細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，目前尚不十分清楚。此外，新近研究表明，PPARγ激動(dòng)劑可下調(diào)TGF-β1基因表達(dá)從而抑制腎間質(zhì)纖維

5、化，其機(jī)制可能與阻斷TGF-β1/Smads信號(hào)通路有關(guān)。但是，在糜酶介導(dǎo)心肌纖維化的病理過(guò)程中有無(wú)TGF-β1/Smads及PPARα信號(hào)途徑的參與，以及這兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間是否存在“信息交流”(cross-talk)，目前也不明確，有待探討。因此，本研究在細(xì)胞和分子水平上觀察心臟糜酶對(duì)大鼠CFs增殖、膠原合成的影響及其細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，探討糜酶在心肌纖維化中的作用機(jī)制；研究PPARα及其激動(dòng)劑非諾貝特對(duì)糜酶介導(dǎo)的TGF-β1/S

6、mads信號(hào)途徑的調(diào)控作用，闡明非諾貝特逆轉(zhuǎn)高血壓心肌纖維化的分子機(jī)制。旨在為臨床防治高血壓左室重構(gòu)提供理論依據(jù)和治療新思路。
　　研究方法:本研究以體外培養(yǎng)的SD大鼠CFs為研究對(duì)象，采用MTT比色法、放射性核素?fù)饺雽?shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期分析、ELISA、RT-PCR及蛋白免疫印記等方法和技術(shù)，觀察：(1)糜酶對(duì)大鼠CFs增殖和膠原合成的影響；(2)糜酶對(duì)大鼠CFs的TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7mRNA和蛋

7、白表達(dá)的影響；(3)PPARα激動(dòng)劑非諾貝特對(duì)糜酶誘導(dǎo)的大鼠CFs增殖和膠原合成的影響；(4)非諾貝特干預(yù)對(duì)大鼠CFs的PPARα、TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá)以及Smad2/3、p-Smad2/3、Smad7蛋白表達(dá)的影響。
　　研究結(jié)果:(1)不同濃度的糜酶作用24h，CFs的數(shù)目呈濃度依賴(lài)性增加，15、30和60ng/ml組A490值分別為0.263±0.033、0.348±0.031和0.387±0.026，均較對(duì)照組(

8、0.201±0.019)顯著增加(P<0.01)。TGF-β1中和抗體預(yù)處理組和絲/蘇氨酸激酶抑制劑預(yù)處理組的A490值均明顯低于30ng/ml糜酶組(P<0.05或P<0.01)，AT1受體拮抗劑預(yù)處理組和AT2受體拮抗劑預(yù)處理組的A490值與糜酶組比較，均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。(2)CFs的DNA合成隨糜酶濃度的增加而增多，15、30和60ng/ml組3H-TdR摻入量分別為319±29、372±43和401±47(cpm/

9、孔)，較對(duì)照組(252±35cpm/孔)明顯升高(P<0.01)。10μmol/L糜酶抑制劑預(yù)處理組的3H-TdR摻入量顯著低于30ng/ml糜酶組(P<0.01)。(3)細(xì)胞周期分析結(jié)果表明，15、30和60ng/ml糜酶作用24h，CFs的G0/G1期細(xì)胞百分率均較對(duì)照組顯著降低(P<0.05或P<0.01)，S期細(xì)胞百分率和增殖指數(shù)(PI)則較對(duì)照組明顯增高(P<0.05或P<0.01)，G2/M期細(xì)胞百分率與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差

10、異(P>0.05)。10μmol/L糜酶抑制劑預(yù)處理組G0/G1期細(xì)胞百分率顯著高于30ng/ml糜酶組(P<0.01)，S期細(xì)胞百分率和PI明顯低于糜酶組(P<0.01)，G2/M期細(xì)胞百分率與糜酶組及照組比較均無(wú)明顯差異(P>0.05)。(4)隨著糜酶濃度的增高，CFs總膠原合成呈遞增趨勢(shì)，15、30和60ng/ml組3H-脯氨酸摻入量分別為520±75、684±62和769±58(cpm/孔)，均較對(duì)照組(435±60cpm/孔)

11、顯著增加(P<0.05或P<0.01)。TGF-β1中和抗體預(yù)處理組和絲/蘇氨酸激酶抑制劑預(yù)處理組的3H-脯氨酸摻入量均顯著低于30ng/ml糜酶組(P<0.05或P<0.01)；AT1受體拮抗劑預(yù)處理組和AT2受體拮抗劑預(yù)處理組的3H-脯氨酸摻入量與糜酶組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。(5)不同濃度的糜酶作用24h，Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)水平呈濃度依賴(lài)性增加，其中15、30和60ng/ml組Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)水平均較對(duì)照

12、組顯著升高(P<0.01)，但7.5ng/ml組與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。(6)隨著糜酶濃度的增高，CFs培養(yǎng)上清中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量呈遞增趨勢(shì)，其中15、30和60ng/ml組Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白含量均較對(duì)照組明顯增加(P<0.05或P<0.01)，但7.5ng/ml組與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。(7)15、30和60ng/ml糜酶作用3h，TGF-β1mRNA表達(dá)水平分別為0.698±0.051、1.0

13、96±0.078和1.242±0.065，均較對(duì)照組(0.299±0.035)明顯增加(P<0.01)。TGF-β1中和抗體預(yù)處理組的TGF-β1mRNA表達(dá)水平明顯低于30ng/ml糜酶組(P<0.05或P<0.01)，但AT1受體拮抗劑和AT2受體拮抗劑預(yù)處理組的TGF-β1mRNA水平與糜酶組比較，均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。(8)15、30和60ng/ml糜酶作用6h，TGF-β1蛋白表達(dá)水平分別為0.968±0.069、1

14、.782±0.058和2.656±0.085，均較對(duì)照組(0.333±0.023)明顯升高(P<0.05或P<0.01)。TGF-β1中和抗體預(yù)處理組的TGF-β1蛋白表達(dá)水平較30ng/ml糜酶組顯著降低(P<0.05或P<0.01)，但AT1受體拮抗劑和AT2受體拮抗劑預(yù)處理組的TGF-β1蛋白水平與糜酶組比較，均無(wú)明顯差異(P>0.05)。(9)不同濃度的糜酶作用6h，Smad2和Smad3的mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組比較，均無(wú)顯著

15、性差異(P>0.05)。(10)在30ng/mL糜酶作用下，3h、6h、12h和24h組p-Smad2/3表達(dá)水平均較對(duì)照組顯著升高(P<0.05或P<0.01)；Smad2/3蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。3h組Smad7蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)；6h、12h和24h組Smad7蛋白水平均顯著低于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)。(11)不同濃度的非諾貝特預(yù)處理后，CFs的數(shù)目呈遞減趨

16、勢(shì)，其中50和100μmol/L組的A490值均較糜酶組顯著較少(P<0.05或P<0.01)。非諾貝特與其拮抗劑共同干預(yù)組的A490值與糜酶組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。100μmol/L非諾貝特單獨(dú)作用對(duì)CFs的數(shù)目無(wú)明顯影響(P>0.05)。(12)不同濃度的非諾貝特預(yù)處理后，CFs的DNA合成呈濃度依賴(lài)性減少，其中50和100μmol/L組均較糜酶組明顯減少(P<0.01)。非諾貝特與其拮抗劑共同干預(yù)組的3H-TdR摻入量

17、與糜酶組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。100μmol/L非諾貝特單獨(dú)作用下，3H-TdR摻入量無(wú)明顯變化(P>0.05)。(13)不同濃度的非諾貝特預(yù)處理后，CFs的G0/G1期細(xì)胞百分率呈遞增趨勢(shì)，S期細(xì)胞百分率和PI則呈遞減趨勢(shì)，其中50和100μmol/L組與糜酶組比較均有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。100μmol/L非諾貝特單獨(dú)作用下，CFs的G0/G1期細(xì)胞百分率、S期細(xì)胞百分率和PI均無(wú)明顯變化(P>0.0

18、5)。(14)10、50和100μmol/L非諾貝特預(yù)處理組CFs的總膠原合成呈濃度依賴(lài)性減少，其中50和100μmol/L組的3H-脯氨酸摻入量均較糜酶組顯著降低(P<0.01)。非諾貝特與其拮抗劑共同干預(yù)組的3H-脯氨酸摻入量與糜酶組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。100μmol/L非諾貝特單獨(dú)作用對(duì)3H-脯氨酸摻入量無(wú)明顯影響(P>0.05)。(15)不同濃度的非諾貝特預(yù)處理后，CFs的Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)水平均呈遞減趨勢(shì)，

19、其中50和100μmol/L組均較糜酶組顯著減低(P<0.01)。非諾貝特與其拮抗劑共同干預(yù)組的Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)水平與糜酶組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。100μmol/L非諾貝特單獨(dú)作用對(duì)Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)均無(wú)顯著影響(P>0.05)。(16)不同濃度的糜酶作用6h，CFs的PPARαmRNA水平呈遞減趨勢(shì)，其中15、30和60ng/ml組均較對(duì)照組明顯減低(P<0.01)。10、50和100μmol/L非諾貝特預(yù)處

20、理后，CFs的PPARαmRNA表達(dá)水平呈濃度依賴(lài)性增加，其中50和100μmol/L組均較糜酶組顯著增加(P<0.05或P<0.01)。100μmol/L非諾貝特單獨(dú)作用后，PPARαmRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)。(17)不同濃度的糜酶作用12h，CFs的PPARα蛋白水平呈濃度依賴(lài)性下降，其中15、30和60ng/ml組較對(duì)照組明顯減少(P<0.05或P<0.01)。10、50和100μmol/L非諾貝特預(yù)處理后

21、，CFs的PPARα蛋白表達(dá)水平呈遞增趨勢(shì)，其中50和100μmol/L組較糜酶組明顯增加(P<0.01)。100μmol/L非諾貝特單獨(dú)作用組的PPARα蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高(P<0.01)。(18)不同濃度的非諾貝特預(yù)處理后，CFs的TGF-β1mRNA表達(dá)水平呈遞減趨勢(shì)，其中50和100μmol/L組均較糜酶組明顯減少(P<0.01)。非諾貝特與其拮抗劑共同干預(yù)組的TGF-β1mRNA水平與糜酶組比較無(wú)顯著性差異(P>0.