不結(jié)球白菜種質(zhì)資源抗TuMV鑒定評(píng)價(jià)及eIF(iso)4E基因克隆和序列分析.pdf

1、不結(jié)球白菜（Brassica campestrisL.ssp.chinensis）是我國(guó)重要蔬菜作物，病毒病的發(fā)生嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)，蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）是主要毒源。篩選不同抗病基因源、深入挖掘抗病基因以促進(jìn)分子標(biāo)記輔助育種仍是防治病毒病最為經(jīng)濟(jì)和安全有效的解決途徑。本論文以不結(jié)球白菜種質(zhì)資源為研究對(duì)象，通過苗期TuMV抗性的鑒定評(píng)價(jià)，篩選不同抗病基因源;選取TuMV抗性差異大的材料為親本，

2、構(gòu)建F2群體，進(jìn)行TuMV抗性的遺傳分析;通過克隆不結(jié)球白菜的eIF(iso)4E.a和eIF(iso)4E.c基因，比較分析序列多態(tài)性位點(diǎn)、不同變異位點(diǎn)對(duì)編碼蛋白的影響以及與TuMV抗性的相關(guān)性。這將為進(jìn)一步明確不結(jié)球白菜抗TuMV的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.利用苗期人工接種鑒定及ELISA檢測(cè)方法，對(duì)127份不結(jié)球白菜種質(zhì)資源進(jìn)行TuMV抗性鑒定。結(jié)果顯示，不同種質(zhì)間表現(xiàn)出較大的抗性差異，病情指數(shù)（DI）分

3、布在3.55～95.68之間。不同抗性級(jí)別的次數(shù)分布圖基本符合正態(tài)分布，略向感病區(qū)域偏離，基于病情指數(shù)的聚類分析結(jié)果與抗病性分級(jí)基本一致。通過苗期鑒定共篩選獲得6份高抗和13份抗TuMV種質(zhì)，主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)出一定的多樣性。117份供試種質(zhì)ELISA檢測(cè)的P/N值分布在3.10～25.37之間，不同種質(zhì)間表現(xiàn)出病毒含量的差異，但與DI值未呈現(xiàn)明顯相關(guān)性，可作為抗病材料篩選的輔助指標(biāo)。
　　2.利用篩選獲得的4份抗性差異較大的材料為

4、親本，構(gòu)建3個(gè)F2群體。群體的TuMV抗病性鑒定結(jié)果顯示，F(xiàn)1均表現(xiàn)感病，F(xiàn)2群體中抗感植株分離比均符合1∶3，推斷兩份抗病材料對(duì)TuMV-C4株系的抗性受一對(duì)隱性基因控制。
　　3.參考白菜基因組Bra035393和Bra035531的測(cè)序結(jié)果，通過克隆測(cè)序分別獲得65份和38份不結(jié)球白菜種質(zhì)的eIF(iso)4E.a和eIF(iso)4E.c基因序列。通過DNAMAN及DNASP軟件比對(duì)分析表明，在eIF(iso)4E.a基因

5、中共有33個(gè)SNP和11個(gè)InDel多態(tài)性位點(diǎn)，產(chǎn)生7種不同單倍型;eIF(iso)4E.c基因有19個(gè)SNP和5個(gè)InDel多態(tài)位點(diǎn)，產(chǎn)生8種單倍型。與已知白菜或油菜的基因序列比對(duì)，分別有13個(gè)(eIF(iso)4E.a）和15個(gè)(eIF(iso)4E.c）變異位點(diǎn)僅在不結(jié)球白菜中發(fā)現(xiàn)。核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)及Sliding-window分析均顯示非編碼區(qū)的多樣性程度遠(yuǎn)高于編碼區(qū)。eIF(iso)4E.a基因編碼區(qū)有8個(gè)SNP變異位

6、點(diǎn)，形成3種CDS，編碼3種蛋白。3個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)導(dǎo)致氨基酸的變化為Asp27His、Thr79Ser和Phe108Ty。在eIF(iso)4E.c基因的5種CDS序列中僅有4個(gè)SNP變異位點(diǎn)，編碼4種蛋白序列，2個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)導(dǎo)致氨基酸變化為Ile80Thr和Pro150Gln。通過SWISS-MODEL軟件進(jìn)行蛋白空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，表明氨基酸變異位點(diǎn)多數(shù)位于帽子口袋附近，導(dǎo)致部分空間結(jié)構(gòu)的改變，推測(cè)可能影響不同蛋白序列中蛋白-蛋白結(jié)合位

7、點(diǎn)的位置和數(shù)目。
　　4.用UCSC/Ensembl、NNPP、PLACE、PlantCARE和ARNold軟件對(duì)5'和3'側(cè)翼序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。結(jié)果顯示，eIF(iso)4E.a基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)位于起始密碼子前52bp處，該基因的表達(dá)可能受光和脅迫調(diào)控，一些SNP或InDel的變異影響調(diào)控元件的有無(wú)或數(shù)量的多少，在終止密碼子后543bp存在不依賴ρ因子的終止子。在eIF(iso)4E.c基因的3'側(cè)翼序列中未預(yù)測(cè)到終止子的存在。