不結(jié)球白菜與TuMV互作過(guò)程中內(nèi)源激素的變化及抗病相關(guān)基因的克隆.pdf

1、不結(jié)球白菜是長(zhǎng)江中下游地區(qū)主要的蔬菜品種之一，在蔬菜周年供應(yīng)上占據(jù)重要地位，但不結(jié)球白菜病害相當(dāng)嚴(yán)重，給廣大菜農(nóng)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。蕪菁花葉病毒病是夏秋季最為嚴(yán)重病害之一。植株受蕪菁花葉病毒(TuMV)侵染后，會(huì)產(chǎn)生一系列細(xì)胞病理效應(yīng)，這種效應(yīng)可能會(huì)引起植株內(nèi)源激素的變化。在植物抗病毒機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，真核翻譯起始因子4E在病毒侵染和復(fù)制過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。本研究揭示了TuMV與不結(jié)球白菜互作過(guò)程中內(nèi)源激素的動(dòng)態(tài)變化及其代謝相關(guān)基

2、因的表達(dá)，并克隆得到了不結(jié)球白菜真核翻譯起始因子4E及其異構(gòu)體基因(BceIF4E和BceIF(iso)4E)，成功構(gòu)建了RNAi表達(dá)載體，為了解TuMV的致病機(jī)制，進(jìn)一步開(kāi)展不結(jié)球白菜病毒抗性研究工作奠定了一定的基礎(chǔ)。
　　 ⑴采用ELISA和Real-time PCR技術(shù)研究了TuMV脅迫下不結(jié)球白菜內(nèi)源生長(zhǎng)素(IAA)，赤霉素(GA3)，脫落酸(ABA)和茉莉酸(JA)的動(dòng)態(tài)變化以及內(nèi)源激素相關(guān)基因的表達(dá)差異。結(jié)果表明，T

3、uMV侵染后，植株發(fā)病癥狀的嚴(yán)重程度與IAA含量呈正相關(guān)；光敏色素相關(guān)蛋白基因PAP1對(duì)IAA的合成起負(fù)調(diào)控作用。處理植株體內(nèi)GA3含量及其代謝相關(guān)基因，即原表皮因子基因PDF1表達(dá)量均明顯低于對(duì)照植株，而ABA含量則隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)不斷積累，始終高于對(duì)照植株。且發(fā)病癥狀越嚴(yán)重的植株中，GA3含量越低，ABA含量越高。處理植株JA含量和JA誘導(dǎo)基因，即營(yíng)養(yǎng)貯藏蛋白基因Vsp1表達(dá)量在接種后則出現(xiàn)了兩次上升，且植株病癥越嚴(yán)重，JA含量越

4、低。TuMV脅迫下，植株中IAA/ABA和GA3/ABA的比值則明顯低于對(duì)照植株，表明TuMV的侵染破壞了內(nèi)源激素的平衡，干擾了植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育。
　　 ⑵從不結(jié)球白菜中克隆到一個(gè)真核翻譯起始因子4E基因，命名為BceIF4E。該基因核苷酸序列全長(zhǎng)851bp，編碼234個(gè)氨基酸，與已克隆的植物真核翻譯起始因子4E具有不同程度的同源性。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，該基因與蕪菁和擬南芥親緣關(guān)系最近。Target P server和WOLFP

5、SOR工程序預(yù)測(cè)該蛋白為細(xì)胞質(zhì)蛋白。利用GatewayTM技術(shù)和pHellsgate12載體，成功構(gòu)建了BceIF4E基因的RNAi表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究BceIF4E在病毒與不結(jié)球白菜互作中的功能提供了理論和技術(shù)支持。
　　 ⑶以不結(jié)球白菜感病品種‘矮腳黃’為試驗(yàn)材料，采用RT-PCR和RACE技術(shù)，獲得了不結(jié)球白菜真核翻譯起始因子4E異構(gòu)體基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并將其命名為BceIF(iso)4E。序列分析表明，該基因全長(zhǎng)

6、721bp，編碼200個(gè)氨基酸。氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，該基因編碼的氨基酸與其他植物的真核翻譯起始因子4E異構(gòu)體具有不同程度的同源性，與蕪菁和擬南芥最先聚為一類，親緣關(guān)系最近。SignalP3.0 Serve程序分析BceIF(iso)4E蛋白可能為非分泌蛋白，Target P server和WOLFPSOR工程序預(yù)測(cè)該蛋白為細(xì)胞質(zhì)蛋白。應(yīng)用GatewayTM技術(shù)體系替代傳統(tǒng)載體構(gòu)建方法，成功構(gòu)建了BceIF(iso)4E基因