不結球白菜抗壞血酸合成相關基因的克隆與表達及BcPMI2的功能分析.pdf

1、抗壞血酸(AsA)，叉稱維生素C，是動植物體內(nèi)維持生命所必需的一種物質。植物的AsA含量由AsA合成和消耗的速率共同決定。高等植物中AsA合成的主要途徑是L-半乳糖途徑，L-半乳糖途徑包括8個典型的生理生化反應，也就對應著8個催化這些反應的酶，植物通過調節(jié)編碼這些酶的基因的表達量改變細胞內(nèi)這些酶的總活力，從而調節(jié)AsA的合成速率和AsA的積累。通過外界或人為地改變一些酶的活力同樣可能影響到植物AsA的積累。
　　 ⑴測量經(jīng)過高p

2、H值處理的植物樣品提取液與未經(jīng)過高pH值處理的提取液在245nm下吸光值的差值，可以計算植物樣品提取液中的還原型AsA的濃度。本研究針對該方法比較了不同的方法降解AsA的效果。最后應用該方法測定不結球白菜樣品的AsA含量，并與紅菲羅啉法測定AsA的結果進行比較，兩種方法對于不同樣品的AsA含量高低關系基本一致。本方法加標回收率在90％以上，同品種的測定結果的標準偏差在2％-12％之間。
　　 ⑵在貯藏過程中采用二氧化碳氣體(CO

3、2)處理采后不結球白菜，減緩了AsA含量的下降。同時發(fā)現(xiàn)其他活性物質，包括可溶性蛋白和葉綠素的損失都可被CO2抑制；CO2處理可抑制過氧化氫清除酶系統(tǒng)中的過氧化氫酶(CAT)，抗壞血酸過氧化物酶(APX)和過氧化物酶(POD)活力的升高，說明高濃度CO2可以降低植物衰老過程中活性氧脅迫的影響，從而減少AsA等活性物質的消耗。50％和100％的CO2處理都可延緩采后不結球白菜貯藏過程中AsA含量的下降，而前者的處理效果要優(yōu)于后者.在室溫下

4、(25℃)CO2處理對AsA的保持效果較明顯，4℃下CO2處理的效果沒有明顯優(yōu)于空氣處理；在CO2處理的條件下，不同溫度處理對AsA的改變也不明顯。
　　 ⑶L-半乳糖途徑各個基因的表達量對AsA積累有決定性的作用。本研究克隆了7個L-半乳糖途徑的相關基因，采用實時定量PCR的手段分析了L-半乳糖途徑的各個基因在AsA含量不同的品種中的表達差異。結果表明不結球白菜品種‘烏塌菜’的AsA含量較高并不是因為L-半乳糖途徑中某個基因的

5、表達量較高。5 mM的茉莉酸甲酯可以短暫地提高AsA含量。L-半乳糖途徑中8個基因，除了BcVTC4，其余的基因均明顯受到茉莉酸甲酯的誘導上調。BcVTC1，BcGME，BcVTC2和BcGLDH4個基因在茉莉酸甲酯處理后的3 h即表現(xiàn)表達量上調，這4個基因可能就是茉莉酸信號誘導AsA積累的幾個調控的靶基因。
　　 ⑷PMI是L-半乳糖途徑第一步反應的催化酶。本研究用轉基因手段將不結球白菜中編碼PMI的基因BcPMI在煙草中過量

6、表達，經(jīng)過GUS組織化學染色，PCR鑒定得到陽性轉基因植株8株；通過RT-PCR檢測，選取目的基因正常表達的P1和P2兩個轉基因植株進行后續(xù)研究。結果表明BcPMI2在煙草中的過量表達不僅沒有提高煙草葉片的AsA含量，反而使正常生長狀態(tài)的煙草的葉片AsA含量降低，同時使葉片的可溶性糖含量降低。但BcPMI2在煙草中的過量表達提高了其葉片的過氧化氫耐受能力；轉基因煙草的葉盤經(jīng)過低濃度的過氧化氫處理3 d，其AsA的含量高于同樣條件處理的野