不結球白菜冷相關CBF基因的鑒定及調(diào)控路徑.pdf

1、白菜類作物原產(chǎn)我國，栽培歷史悠久且品種豐富。在植物學分類上，白菜類作物隸屬十字花科(Cruciferae)蕓薹屬(Brassica)，主要包括大白菜（Brassica rapa ssp.pekinensis）、不結球白菜（Brassica rapa ssp.chinensis）和蕪菁（Brassica rapa ssp.rapa）。其中，不結球白菜是我國長江中下游廣泛種植的大眾蔬菜。與擬南芥一樣，不結球白菜也通過一系列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制來誘

2、發(fā)冷馴化，從而提高其耐寒性，而由CBF轉(zhuǎn)錄因子家族基因主導的CBF冷響應通路是這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制中最重要的組成之一。因而系統(tǒng)的研究CBF冷響應通路對于更好的認識不結球白菜的抗寒甚至其他環(huán)境脅迫的調(diào)控機制非常重要。本研究分離和克隆了不結球白菜的CBF基因，分析其脅迫表達模式及調(diào)控特點，并進一步研究上游Bc WRKY33對BcCBF3基因的調(diào)控關系;通過小RNA測序技術挖掘CBF在關聯(lián)不結球白菜的抗寒和病原響應機制中的作用;此外，對近緣亞種大

3、白菜進行MYB轉(zhuǎn)錄因子的全基因組鑒定分析，并以此作為對不結球白菜及整個白菜類作物CBF基因上游調(diào)控因子MYB的研究的參考。本文主要研究結果如下:
　　1.從不結球白菜品種‘蘇州青’中分離得到8個CBF同源基因，其編碼的BcCBF蛋白與擬南芥中的同源蛋白相似性較高。實時定量PCR(qPCR)分析表明，BcCBF1～3被冷脅迫(4℃)而非干旱或脫落酸(ABA)誘導，它們參與了ABA-獨立路徑;而BcCBF4～6的表達受到干旱和ABA調(diào)

4、控，它們參與ABA-依賴路徑。與擬南芥的同源基因不同，BcCBF4～6表現(xiàn)出的低溫和ABA響應，暗示在不結球白菜中，CBF通路的ABA依賴路徑和ABA獨立路徑并不是完全分開的，而這些基因可能作為兩者的聯(lián)系點。
　　2.利用Gateway技術構建了4個不結球白菜BcCBF基因的過量表達載體，轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞進行亞細胞定位，結果表明這四個BcCBF蛋白都定位在細胞核中。用含有BcCB F3-pEarleyGate103的農(nóng)桿菌蘸花法轉(zhuǎn)

5、化擬南芥;通過酶切連接獲得BcCBF3的甘藍縮葉病毒(Cblcv)誘導的基因沉默載體BcCBF3-PCVA并得到不結球白菜的瞬時表達轉(zhuǎn)基因植株。在擬南芥中，AtCBF2受到BcCBF3過表達顯著抑制，而實時定量分析表明BcCBF2的表達與BcCBF3無直接關系。其上游的BcMYB15則受BcCBF表達量的反饋抑制，下游BcCOR15A表達與BcCBF3正相關并放大其表達的變化。
　　3.對BcCBF3的啟動子序列進行分析，鑒定出兩

6、個WRKY結合順式元件W-box。鹽處理表達模式及煙草的GUS染色結果表明兩個W-box對于WRKY的結合都有作用。進一步對Bc WRKY33的過量表達不結球白菜中CBF相關基因進行表達分析，結果表明BcWRKY33的組成型表達激活了BcCBF3的轉(zhuǎn)錄，而在低溫下它們的表達變化都要大于未處理時。BcCBF4在轉(zhuǎn)基因植株中的表達模式表明雖然它與WRKY33都響應ABA，但彼此對ABA的響應機制是獨立的。此外，BcWRKY33的原核表達獲得

7、了BcWRKY33-GST重組蛋白，為實驗驗證蛋白-DNA互作打下基礎。
　　4.以感染蕪菁花葉病毒和健康的葉子為材料進行小RNA測序，測序挖掘出86個保守和45個新的的miRNA。其中，共69個miRNA響應TuMV侵染，包括42個下調(diào)和27個上調(diào)miRNA。利用生物信息學方法預測的共有271個靶基因，這些基因主要參與發(fā)育調(diào)控和脅迫響應。選擇了13個miRNA及其相應的靶基因，探索其在TuMV或冷脅迫下的表達模式。結果表明，一些

8、TuMV響應的miRNA也被低溫誘導，其可能作為兩種脅迫響應機制的聯(lián)結。
　　5.對白菜類作物CBF基因的啟動子順式元件進行分析，結果顯示其都含有MYB結合元件，表明MYB轉(zhuǎn)錄因子在白菜類作物CBF上游調(diào)控中具有普遍性作用。隨后，從大白菜中鑒定出了256個R2R3-MYB基因，通過進化樹分析將大白菜中的273個R2R3-、3R-和非典型的MYB蛋白分成45個亞組。RNA表達譜數(shù)據(jù)和實時定量PCR(qPCR)分析則反映了R2R3-B