神經膠質細胞和膠質瘤細胞中脂肪酸β-氧化和膽固醇代謝相關基因mRNA的表達.pdf

1、目的：極長鏈脂肪酸(VLCFA)是對細胞有毒的物質，經過氧化物酶體β-氧化途徑分解解毒。途經中的酶缺陷的病人，以及該酶基因敲除的大鼠，VLCFA都在腦中積聚，影響神經元的遷移，引起脫髓鞘，對神經系統產生毒性，從而導致新生兒腦畸形或腦發(fā)育不良。高膽固醇也是阿爾茨海默病發(fā)生發(fā)展的危險因素。但是，目前對中樞神經系統(CNS)中的脂肪酸和膽固醇代謝還知之甚少，因而研究組成腦組織的膠質細胞中與脂肪酸、膽固醇代謝相關基因的表達具有重要的理論和實際意

2、義。 脂肪酸β-氧化主要在線粒體和過氧化物酶體中進行。線粒體主要氧化短鏈和中長鏈的脂肪酸。肉堿脂酰轉移酶Ⅰ (CPT-1)是線粒體脂肪酸β-氧化的限速酶。過氧化物酶體主要氧化VLCFA。參與過氧化物酶體脂肪酸β-氧化的酶包括脂酰CoA氧化酶1(Acox1)、脂酰CoA氧化酶2(Acox2)、脂酰CoA氧化酶3(Acox3)、L-雙功能蛋白(LBP)、D-雙功能蛋白(DBP)、硫解酶A(THLA)、硫解酶B(THLB)和固醇攜帶蛋

3、白x(SCPx)。研究表明Acox1、DBP和T肌A在大鼠腦組織有表達，其中DBP在神經元表達。神經膠質細胞是神經細胞中的重要群體，起營養(yǎng)、支持和協助神經元的作用。腦膠質瘤是起源于神經膠質細胞的腫瘤。在大腦組織表達的與脂肪酸代謝有關的基因，是否在膠質細胞中有表達? 與過氧化物酶體脂肪酸β-氧化相關的酶的基因中有哪些基因也在神經膠質細胞表達?膠質瘤細胞中這些相關基因的表達是否與膠質細胞一樣?未見報道。調節(jié)細胞內脂肪酸代謝的過氧化物

4、酶體增殖物激活受體α(PPARa)在神經元有表達，但在膠質細胞是否有表達?未見報道。因此，本實驗在成功培養(yǎng)皮質神經膠質細胞的基礎上，分別測定了膠質細胞和膠質瘤細胞中PPAR<,α>、CPT-1、Acox1、Acox2、Acox3、DBP、LBP、THLA、THLB、SCPx mRNA的表達，以探討脂肪酸在神經膠質細胞和膠質瘤細胞中的代謝機制和神經膠質細胞在CNS中的功能。 成年鼠腦的膽固醇主要在膠質細胞內合成，羥甲基戊二酸單酰C

5、oA還原酶(HMGR)是膽固醇合成的限速酶。膠質細胞內的膽固醇與其細胞膜上ATP結合盒轉運體A1(ABCA1)結合，被呈遞到胞外載脂蛋白上。神經元膜上B類I型清道夫受體(SR-BI)攝入載脂蛋白上的膽固醇。神經元內，膽固醇24S-羥化酶(CYP46)可催化膽固醇生成24S-羥膽固醇，進而通過血腦屏障進入血液循環(huán)，入肝轉化成膽汁酸后排出體外。調節(jié)膽固醇代謝的肝X受體(LXRn)也在腦組織中表達。我室以前的研究也表明，在腦組織中表達的LXR

6、<,α>、HMGR、CYP46、ABCA1和SR-BI基因，既在神經元也在神經膠質細胞中表達。但在膠質瘤細胞中這些基因的表達如何?未見報道。鑒于此，我們測定了原代培養(yǎng)的神經膠質細胞和膠質瘤細胞中LXR<,α>、HMGR、CYP46、ABCA1和SR-BI轉錄的表達水平，以探討膠質瘤細胞中膽固醇的代謝機制，為研究脂類代謝與膠質瘤的關系奠定基礎。 方法： 1、皮質神經膠質細胞的原代培養(yǎng)取新生3天的SD大鼠斷頭取腦置DMEM中

7、。鈍性剝出皮質并將皮質剪成1mm<'3>小塊，移入消化液(0.125％胰蛋白酶，pH 7.4 PBS配制)中，放入37℃培養(yǎng)箱中消化30min。待組織塊下沉后棄去上清，加入等體積種植液(含10％標準胎牛血清和100u/ml青、鏈霉素的DMEM)終止消化10min并洗滌兩次。再加入等體積種植液，用尖端經火焰刨光的Pasteur吸管緩慢吹打25次左右使組織團塊完全消失，吸出上層單細胞懸液，計數，調整細胞密度為1×10<'6>/ml，接種于L

8、-多聚賴氨酸處理的6孔培養(yǎng)板中，每孔1ml。置37℃，5％CO<,2>及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。以后每3天換培養(yǎng)液(含10％標準胎牛血清和100u/ml青、鏈霉素的DMEM)一次。 2、C6細胞的培養(yǎng)用RPMI1640培養(yǎng)液常規(guī)傳代培養(yǎng)，取第10～15代細胞用于本實驗。 3、分組 分為神經膠質細胞組(Glia)和膠質瘤細胞組(C6)。 4、皮質神經膠質細胞的鑒定用膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)抗體進行免

9、疫細胞化學染色來鑒定膠質細胞的性狀與純度。 5、細胞總RNA的提取用Trizol一步法提取。 6、mRNA表達的定量用GAPDH作為內參照，利用RT-PCR法測定原代培養(yǎng)的膠質細胞和膠質瘤細胞中PPAR<,α>、LXR<,α>、CPT-1、CAT、Acox1、Acox2、Acox3、DBP、LBP、THLA、THLB、SCPx、HMGR、CYP46、ABCA1和SR-BI的相對表達量。 結果： 1、皮質神

10、經膠質細胞的形態(tài)學觀察相差顯微鏡下觀察，細胞在接種12h后大部分貼壁，圓形或橢圓形，光暈明顯，部分細胞有小突起伸出，細胞分散均勻。培養(yǎng)第3～4 d，細胞生長迅速，形成群落，可見較多的核分裂相，細胞體積和數量增加，突起增多，單個的膠質細胞胞體較大，胞核明顯，呈圓形或卵圓形，偏于胞體一側，周圍可見混雜生長的少數神經元。培養(yǎng)第6～7 d，星形膠質細胞呈現出多邊形和纖維形兩種形態(tài)，群落之間開始融合成片，形成以星形膠質細胞為主的地毯樣地層。隨著培

11、養(yǎng)時間延長，神經元開始退化并漂浮于培養(yǎng)液中。培養(yǎng)第13～14 d，少突膠質細胞開始生長，體積小，折光性強，有細小突起沿胞體呈放射狀分布，位于表層，而底層的星形膠質細胞群落之間完全融合并鋪滿板底。 2、免疫細胞化學染色用膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)抗體進行免疫細胞化學染色來鑒定膠質細胞的性狀與純度，結果表明星型膠質細胞占培養(yǎng)細胞的85％，能夠滿足我們的實驗要求。 3、細胞中CAT mRNA相對表達量的變化Glia組和C6

12、組均有CAT mRNA的表達；且兩組間的差別(2.406±0.318 vs 2.578±0.221)無統計學意義(P>0.05)。表明膠質細胞和膠質瘤細胞中都存在過氧化物酶體。 4、細胞中CPT-I mRNA相對表達量的變化Glia組和C6組均有CPT-1 mRNA的表達；C6組CPT-1mRNA的相對表達量(2.371±0.294)明顯高于Glia組(1.364±0.232，P<0.01)。表明膠質瘤細胞中線粒體β-氧化高于膠

13、質細胞。 5、細胞中Acox1、Acox2和Acox3 mRNA相對表達量的變化Glia組有Acox1和Acox2 mRNA的表達而無Acox3mRNA的表達；C6組有Acox1和Acox3 mRNA的表達而無Acox2 mRNA的表達；且C6組Acox1 mRNA的相對表達量(2.777±0.342)明顯高于Glia組(1.873±0.240，P<0.01)。 6、細胞中DBP和LBP mRNA相對表達量的變化Gli

14、a組和C6組均有DBP mRNA的表達而無LBP mRNA的表達；且兩組間差別(0.919±0.128 vs 1.079±0.207)無統計學意義(P>0.05)。 7、細胞中THLA、THLB和SCPx mRNA相對表達量的變化Glia組有THLA和SCPx mRNA的表達而無THLBmRNA的表達；C6組有THLA和THLB mRNA的表達而無SCPx的表達；且THLAmRNA在兩組間的差別(0.188±0.024 VS 0

15、.187±0.031)無統計學意義(P>0.05)。 8、細胞中PPARa mRNA相對表達量的變化Glia組和C6組均有PPARa mRNA的表達；C6組PPARamRNA的相對表達量(1.064±0.121)明顯高于Glia組(0.463+0.091，P<0.01)。 9、細胞中LXRa mRNA相對表達量的變化Glia組和C6組均有LXRa mRNA的表達；且兩組間的差別(0.734±0.147 vs 0.746+

16、0.134)無統計學意義(P>0.05)。 10、細胞中HMGR mRNA相對表達量的變化Glia組和C6組均有HMGR mRNA的表達；C6組HMGRmRNA的相對表達量(2.324±0.100)明顯高于Glia組(1.175±0.189，JF)

17、中ABCA1和SR-BI mRNA相對表達量的變化Glia組和C6組均有ABCA1和SR-BI mRNA的表達；C6組SR-BI mRNA的相對表達量(1.778±0.214)明顯高于Glia組(1.107±0.185，P<0.01)；ABCA1 mRNA的表達在兩組間的差別(1.397±0.270 vs 1.255±0.227)無統計學意義(p>0.05)。 結論： 1、過氧化物酶體氧化不飽和直鏈VLCFA和支鏈VLC