熒光定量PCR分型法檢測乙肝病毒B、C基因型的方法學評價及應用研究.pdf

1、目的：對本實驗室建立的熒光定量分型PCR法的反應條件和反應體系進行優(yōu)化,并對其進行方法學評價,檢驗初步臨床應用效果,明確重慶地區(qū)HBV基因型分布情況。
　　 方法：從退火溫度、探針引物濃度比方面對熒光定量分型PCR反應進行優(yōu)化,建立熒光定量PCR的標準曲線,并對該方法的靈敏度、特異性、重復性指標進行初步評價。通過將熒光定量分型PCR法與直接測序法和多重PCR分型法比較,并用TA克隆測序法對檢測結果不一致的樣本進行驗證,對熒光定量

2、分型PCR法進行進一步評價。最后將熒光定量分型PCR法用于檢測207份重慶地區(qū)HBV感染者的基因型,觀察其臨床初步應用效果。
　　 結果：經(jīng)過優(yōu)化后將熒光定量分型PCR法的退火溫度定為62℃,探針濃度定為0.3μM,引物濃度定為0.5μM。該分型法的線性范圍為102-109copies/ml,靈敏度高,特異性強,重復性好,具有操作簡便、檢出快速的優(yōu)點。在對113份樣本進行分型檢測中,熒光定量分型PCR和直接測序法檢出率100％,

3、多重PCR法檢出率94.69%,6份樣本未能分型。熒光定量分型PCR和多重PCR的Kappa系數(shù)0.915,熒光定量分型PCR和直接測序法的Kappa系數(shù)0.742,一致性均較好。對B、C基因型混合感染樣本,熒光定量分型PCR法檢出28例(24.78%),多重PCR法檢出19例(16.81%),直接測序法檢出13例(16.81%)。熒光定量分型對基因型混合感染樣本的檢測靈敏度明顯高于直接測序和多重PCR分型法。在對重慶地區(qū)HBV基因型分

4、布特征的調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn),B型127例(61.35%),C型29例(14.01%),BC混合型48例(23.19%),B型為主要基因型,B/C混合型感染率高。C基因型的病毒載量高于B型及BC混合型(P＜0.05),B基因型與BC混合型的病毒載量無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 結論：本實驗室建立的熒光定量分型PCR法是一種可靠、高效、快速、簡便的HBV基因分型法,尤其對混合基因型感染的檢測靈敏度高。此分型方法針對我國主要分布的