熒光光譜法檢測乙肝病毒HBV-DNA和凝血酶的研究.pdf

1、乙肝病毒是當(dāng)前傳染性很強(qiáng)的一種病毒,可引起慢性肝炎和肝硬化。因此,發(fā)展一種高靈敏的和高選擇性的檢驗(yàn)乙肝病毒的方法成為熱點(diǎn)課題之一。凝血酶是一種常見的蛋白質(zhì),它在分子生物學(xué)中起著重要的作用,許多工作都致力于發(fā)展靈敏度高的凝血酶傳感器。核酸適體與靶分子之間分子的識(shí)別功能與抗體與抗原的識(shí)別非常相似,作為一種新型的分子識(shí)別工具,可以與適配體作用的靶分子種類很多(包括免疫原性弱及不具有免疫原性的物質(zhì)和毒素),同時(shí),核酸適體具有自身穩(wěn)定性強(qiáng)、易功能

2、化修飾、變性復(fù)性快速、可逆標(biāo)記和可作為優(yōu)良的納米器件等優(yōu)點(diǎn)。因此,核酸適體作為識(shí)別分子的分析技術(shù)得到迅速的發(fā)展。
　　 本論文主要分為以下四個(gè)部分:
　　 (1)利用核酸外切酶Ⅲ降解雜交的DNA鏈,將熒光素修飾的DNA探針釋放到溶液中,通過測定溶液的熒光強(qiáng)度來測定乙肝病毒(HBV-DNA)的濃度。考察了緩沖溶液的種類、pH、反應(yīng)時(shí)間等對(duì)反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度的影響,確定了最佳反應(yīng)條件:最佳緩沖溶液為TT緩沖溶液(pH8.0,2

3、50 mM Tris-HCl,0.1％(V/V)Tween20),緩沖溶液的最佳pH為9.0,生物素與親和素最佳結(jié)合時(shí)間為25 min,DNA的最佳雜交時(shí)間為20 min,酶反應(yīng)最佳時(shí)間為1.1 h。在最佳反應(yīng)條件下,隨著HBV-DNA濃度的增加,體系的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。該方法測定HBV-DNA的線性范圍為5.0×10-13～5.0×10-12M,檢測限為3.35×10-13M。
　　 (2)利用納米金放大的方法,將修飾熒光素的

4、信號(hào)DNA連接在納米金表面,納米金通過HBV-DNA與磁珠連接,1,4-二硫蘇糖醇(DTT)可以替代信號(hào)DNA連接在納米金表面,使熒光素標(biāo)記的信號(hào)DNA脫離納米金到溶液中,測定溶液的熒光強(qiáng)度可以得到HBV-DNA的濃度。磁珠不僅可以用來磁性分離,還可以降低DNA的非特異性吸附。同時(shí),納米金有放大信號(hào)的功能?；诩{米金放大原理的熒光光譜體系中測定的HBV-DNA的檢測限為2.18×10-14M。
　　 (3)利用涂覆親和素的96孔

5、板和納米金磁性微球來檢測HBV-DNA的濃度。納米金磁性微球不僅可以放大信號(hào),還可以利用其可磁性分離的特點(diǎn)減小DNA的非特異性吸附。利用DTT代替反應(yīng),使得修飾熒光素的信號(hào)DNA脫離納米金磁性微球表面懸浮在溶液中,通過熒光光譜法測定溶液中的熒光強(qiáng)度來得到HBV-DNA的濃度。信號(hào)的放大和低背景使得該方法檢測限為7.52×10-15M,可用于隨時(shí)檢測HBV-DNA的濃度。
　　 (4)基于凝血酶與其兩種適體之間特異性結(jié)合設(shè)計(jì)了一種

6、靈敏的和特異性的夾心結(jié)構(gòu)來檢測凝血酶的濃度。連接在納米金表面的識(shí)別DNA(S3)與引發(fā)DNA(S4)可部分雜交,由于取代DNA(S5)與識(shí)別DNA可完全雜交,從而引發(fā)DNA被釋放到溶液中。溶液中的S4可打開發(fā)卡DNA S6,被打開的S6又可以打開發(fā)卡DNAS7而釋放S4重新回到溶液中,釋放到溶液中的S4可打開S6引發(fā)下一輪循環(huán)反應(yīng)。這樣的循環(huán)反應(yīng)可增大熒光信號(hào),提高檢測的靈敏度,檢測限為4.3×10-13M。用牛血清蛋白和溶菌酶來檢驗(yàn)該