外加低壓穩(wěn)恒直流電場對兔急性心肌梗死后血管生成的作用及機(jī)制研究.pdf

1、一、背景與目的：
　　 冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)是當(dāng)今人類健康的“頭號敵人”，冠心病治療費(fèi)用也位列許多國家政府衛(wèi)生保健支出之首。如何有效地防治冠心病成為臨床心血管病學(xué)的重要課題。雖然經(jīng)皮冠狀動脈介入(PCI)治療或/和冠狀動脈旁路移植術(shù)(CABG)并聯(lián)合強(qiáng)化的藥物治療獲得重要突破和進(jìn)展，但仍有部分冠心病患者不能有效恢復(fù)完全的心肌血流灌注，還有20％～70％的冠心病患者不能施行PCI或CABG，或者接受了不完全的血運(yùn)重建

2、，使患者死亡率增高，臨床預(yù)后險惡。治療性血管生成通常利用外源性重組基因治療以促進(jìn)缺血心肌的側(cè)支循環(huán)形成，使冠脈灌注得以恢復(fù)，從而改善心臟功能和臨床預(yù)后，是嚴(yán)重缺血性心臟病患者傳統(tǒng)治療措施的補(bǔ)充或替代方法。
　　 組織損傷后產(chǎn)生內(nèi)源性電場，這是種穩(wěn)恒直流電場，具有促進(jìn)損傷愈合等生物學(xué)效應(yīng)。損傷和缺血組織中存在電勢差，當(dāng)這個直流電場達(dá)到150～400mv/mm時，能促使包括平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的所有的血管壁細(xì)胞明顯地延長、垂直取

3、向和定向遷移，從而觸發(fā)血管新生、并進(jìn)一步發(fā)展成熟為具有功能作用的側(cè)支循環(huán)。因而，穩(wěn)恒直流電場刺激可望成為治療性血管生成的新希望。組織缺血缺氧是血管生成的原始刺激因素，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是血管形成的特異性和關(guān)鍵性生長因子。缺血導(dǎo)致心肌細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)的激活，進(jìn)一步刺激VEGF等生長因子的表達(dá)，而磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶(PI3K/Akt)通路在通過HIF-1α調(diào)節(jié)的VEGF的表達(dá)中起重要作用。第10號

4、染色體丟失的張力蛋白同源的磷酸酶基因(PTEN)，對P I3K/Akt信號通路起負(fù)調(diào)節(jié)作用。最近的研究證實(shí)外加電場對細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)是通過PTEN/PI3K信號途徑來發(fā)揮作用的。
　　 本課題在以往研究的基礎(chǔ)上以兔心臟為研究的基本模型，對外加低壓穩(wěn)恒直流電刺激直接作用于心臟的安全性、血管生成的有效性、血管生成后對兔心功能的影響進(jìn)行全面的分析，并進(jìn)一步探討外加低壓穩(wěn)恒直流電影響急性心肌梗死(AMI)后梗死邊緣區(qū)血管生成的可能機(jī)制。

5、
　　 二、方法：
　　 第一部分外加低壓穩(wěn)恒直流電場對AMI兔的安全性評估。
　　 日本大耳兔30只，隨機(jī)分為治療組和對照組。家兔開胸后直接在心外膜上，在結(jié)扎的冠狀動脈左回旋支的兩側(cè)平行安放一對刺激電極。電極為含量99％鉑(Pt)條改制的長10.0mm、寬1.0mm、厚0.5mm片狀鉑金電極頭。術(shù)后立即給予電場強(qiáng)度4.0V/cm、30min/d直流電治療，直至術(shù)后4周。觀察低壓穩(wěn)恒直流電場對家兔呼吸、循環(huán)、心電

6、生理、血液、血生化以及病理組織學(xué)的影響。
　　 第二部分外加低壓穩(wěn)恒直流電場對兔AMI后血管生成的影響及其效應(yīng)
　　 日本大耳兔95只，隨機(jī)分為假手術(shù)組(SH組)、心肌梗死組(MI組)、電治療組(EFs組)[包括2.0V/cm電治療組(2EFs組)和4.0V/cm電治療組(4EFs組)]，除SH組以外，其余三組分別觀察術(shù)后1天、3天、5天、7天、2周和4周6個時相點(diǎn)，每組5只兔。在相應(yīng)的模型建立后第二天開始，給予兔體外施

7、加低壓穩(wěn)恒直流電刺激(電場強(qiáng)度2.0V/cm或4.0V/cm)，持續(xù)30min/d，直到術(shù)后各組觀察終點(diǎn)。多導(dǎo)生理儀有創(chuàng)監(jiān)測左室血流動力學(xué)參數(shù)和股動脈壓；處死動物后，測量左、右心室的重量；通過Masson染色判斷梗死面積；VⅢ因子免疫組化染色觀察毛細(xì)血管密度；RT-PCR檢測單核細(xì)胞趨化蛋白-1的表達(dá)以判斷炎癥反應(yīng)強(qiáng)度；RT-PCR及Western-blot檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的表達(dá)。
　　 第三部分外加低壓穩(wěn)恒

8、直流電場促進(jìn)兔AMI后血管生成的機(jī)制
　　 在第二部分研究基礎(chǔ)上，增加以羅格列酮干預(yù)的18只兔。以免疫組化方法、RT-PCR及Western-bolt觀察上述各組缺血心肌組織VEGF的表達(dá)；免疫組化方法及RT-PCR檢測HIF-1α的表達(dá)；RT-PCR及Western-bolt觀察羅格列酮干預(yù)前后PTEN的表達(dá)；VⅢ因子免疫組化染色觀察羅格列酮干預(yù)前后心肌毛細(xì)血管密度。
　　 三、結(jié)果：
　　 (1)通過胸骨正中

9、切口開胸、結(jié)扎左冠狀動脈回旋支(LCX)建立AMI的方法，不用氣管插管或氣管切開建立人工輔助呼吸，簡化了手術(shù)操作、保持胸膜的完整、避免胸腔大血管的損傷，減少了感染和出血等并發(fā)癥的發(fā)生。
　　 (2)經(jīng)過改良后的鉑電極，電極頭面積較早期實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的增加近2/3并鑿刻小槽，有利于電極固定在心外膜上。電極柔韌性增加，通過延長的皮下隧道固定于兔的頸背部的方法便于手術(shù)操作、安全、可靠，有效地降低了電極脫落的機(jī)率。
　　 (3)4.

10、0V/cm、30min/d的低壓穩(wěn)恒直流電場對AMI兔在手術(shù)后4周之內(nèi)，無論是呼吸、循環(huán)、血液、生化、心肌病理組織學(xué)改變還是一般情況等，與對照組比較無顯著差異，提示都是安全的。
　　 (4)低壓穩(wěn)恒直流電場治療后，兔MI邊緣區(qū)心肌組織中毛細(xì)血管的密度比MI對照組顯著增多，尤其在4.0V/cm場強(qiáng)的電治療組。毛細(xì)血管的密度在術(shù)后第5天達(dá)到高峰，此后稍有減少并穩(wěn)定至術(shù)后4周。同時EFs組在術(shù)后4周MI面積較MI組縮小，左心室功能顯著

11、改善。
　　 (5)AMI后心肌組織中MCP-1表達(dá)較SH組顯著增加，但EFs組和MI組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；術(shù)后4周，EFs組MMP-2表達(dá)較MI組顯著降低。
　　 (6)MI缺血心肌組織中HIF-1α以及VEGF表達(dá)較正常心肌組織增加，給予外加低壓穩(wěn)恒直流電刺激后在一定時間窗內(nèi)可顯著促進(jìn)梗死邊緣區(qū)心肌組織中HIF-1α以及VEGF的表達(dá)；
　　 (7)正常心肌組織中PTEN高表達(dá)，心肌梗死后PTEN表達(dá)下調(diào)。外加低壓

12、穩(wěn)恒直流電刺激后3天內(nèi)使梗死邊緣區(qū)心肌組織中PTEN表達(dá)較對照組降低，隨后PTEN表達(dá)在電場干預(yù)下迅速增加，并在術(shù)后4周達(dá)到較高的水平；
　　 (8)羅格列酮可使缺血心肌組織中PTEN表達(dá)顯著增加并伴隨著VEGF表達(dá)和毛細(xì)血管密度的降低，提示低壓穩(wěn)恒直流電刺激可能通過PTEN/PI3K/Akt/HIF-1α/VEGF通路促進(jìn)MI后梗死邊緣區(qū)心肌組織血管生成的增加。
　　 四、結(jié)論：
　　 (1)4.0V/cm、3

13、0min/d的外加低壓穩(wěn)恒直流電場對兔AMI后4周之內(nèi)，無論是對呼吸、循環(huán)、血液、生化、心肌病理組織學(xué)改變的影響還是一般情況等，與對照組比均無顯著差異，提示是安全的。
　　 (2)外加低壓穩(wěn)恒直流電治療4周后，MMP-2表達(dá)較MI組顯著降低，MI面積縮小，同時左心室心肌肥厚指數(shù)下降，左室收縮功能明顯改善，尤其在4.0V/cm場強(qiáng)的電治療組。
　　 (3)外加低壓穩(wěn)恒直流電場治療后，梗死邊緣區(qū)心肌組織中毛細(xì)血管的密度比MI

14、對照組顯著增加，尤其在4.0V/cm場強(qiáng)的電治療組。延長電刺激的時間，毛細(xì)血管密度并沒有繼續(xù)進(jìn)一步增加。
　　 (4)外加低壓穩(wěn)恒直流電刺激后早期，缺血心肌組織中PTEN表達(dá)較MI對照組降低，同時VEGF及HIF-1α表達(dá)升高；羅格列酮藥物干預(yù)后PTEN表達(dá)增加并伴隨著VEGF表達(dá)和毛細(xì)血管密度顯著降低，提示外加低壓穩(wěn)恒直流電刺激可能通過PTEN/PI3K/Akt/HIF-1α/VEGF通路，促進(jìn)MI后梗死邊緣區(qū)心肌組織血管生成