Stx噬菌體病毒相關(guān)特性及Stx毒素的誘導(dǎo)特征.pdf

1、大腸桿菌O157是產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（STEC）的主要血清型，可以引起人和動物的腹瀉、出血性結(jié)腸炎，并可以進(jìn)展為溶血性尿毒綜合征、血栓性血小板減少性紫癜。已知產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的毒力因子主要有LEE毒力島、溶血素、耐熱腸毒素和志賀毒素（Stxs）。Stxs在100多個血清型的大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，它們是STEC的主要毒力因子之一。Stxs包括兩個生物型：Stx1和Stx2，它們大都由溶源性噬菌體（Stx噬菌體）編碼，Stx噬菌體的溶源轉(zhuǎn)換與細(xì)

2、菌分泌Stxs以及細(xì)菌毒力密切相關(guān)。所以對Stx噬菌體相關(guān)特性及Stx毒素誘導(dǎo)特征的研究有助于揭示噬菌體介導(dǎo)的毒力基因水平傳播與毒素釋放之間的相關(guān)性，從一個全新的、本質(zhì)的角度來監(jiān)測、預(yù)防、控制STEC O157的感染。 本試驗采用二重PCR對62株大腸桿菌菌株進(jìn)行stx基因檢測，篩選到8株同時含有stx1和stx2基因的O157菌株，將這些菌株應(yīng)用絲裂霉素C進(jìn)行噬菌體誘導(dǎo)，MC1061作指示菌檢測濾液中的噬菌體，PCR檢測濾液中

3、噬菌體DNA stx基因。制備抗大腸桿菌素的突變株MC1061(colicin)和Stx2噬菌體的溶源菌株MC1061(colicin)：：Stx2，利用MC1061(colicin)：Stx2作為指示菌篩選濾液中Stx2噬菌體以外的噬菌體。并對其中一株Stx2噬菌體A亞單位進(jìn)行測序驗證。結(jié)果顯示8株大腸桿菌O157溶源菌株經(jīng)絲裂霉素C誘導(dǎo)后均優(yōu)先釋放Stx2噬菌體，不釋放Stx1噬菌體。通過多次純化，獲得8株Stx2噬菌體。通過比對發(fā)

4、現(xiàn)Stx2噬菌體ΦPB0308-2 A亞單位核苷酸序列與GenBank中多株Stx2噬菌體（X07865、AP005154、AF548457、AP000363）相應(yīng)序列的同源性高達(dá)99％。本試驗不僅鑒定了大腸桿菌O157溶源菌株誘導(dǎo)后優(yōu)先釋放的是Stx2噬菌體，驗證了stx基因在大腸桿菌菌株間的水平轉(zhuǎn)移，同時還建立了指示多種Stx噬菌體的優(yōu)化方法，將有助于對Stx噬菌體的進(jìn)一步研究。 將實驗室分離的8株Stx2噬菌體作為試驗材料

5、進(jìn)行相關(guān)特性研究。采用隨機引物法（Dig－dUTP）標(biāo)記了789bp的stx2 基因片段作為探針進(jìn)行Southern blot。測定Stx2噬菌體增殖效價、將其中的6株噬菌體進(jìn)行電鏡觀察，并對其基因組大小、酶切片段的多態(tài)性和蛋白質(zhì)組成進(jìn)行了初步分析。Southern blot結(jié)果進(jìn)一步驗證了該8株噬菌體均為Stx2噬菌體，各噬菌體的增殖效價高，從108PFU/mL～1010PFU/mL不等。電鏡下觀察到的6株Stx2噬菌體形態(tài)基本一致，

6、頭部均為正六邊形，尾部很短。各噬菌體之間存在著相同的蛋白結(jié)構(gòu)模式，但是限制性內(nèi)切酶片段長度表現(xiàn)出一定的多態(tài)性，噬菌體的基因組大小從48.0kb～65.3kb不等。 Stx2噬菌體能夠介導(dǎo)stx基因在大腸桿菌菌株間的水平轉(zhuǎn)移，而某些抗生素又能誘導(dǎo)Stx噬菌體的釋放，但抗生素對Stx毒素的誘導(dǎo)作用還沒有一個明確的結(jié)論。本試驗選用絲裂霉素C作誘導(dǎo)劑，研究了誘導(dǎo)前后以及誘導(dǎo)后8h、12h、16h四個階段濾液中Stx的表達(dá)量，毒素表達(dá)量采