細(xì)胞因子IL-2，15聯(lián)合自體DCs對(duì)人外周血來(lái)源的NK細(xì)胞體外擴(kuò)增及功能影響的研究.pdf

1、目的意義：供者異源反應(yīng)性NK細(xì)胞在異基因造血干細(xì)胞移植中可以發(fā)揮移植物抗白血病（graft-versus-leukemia，GVL）效應(yīng)，并減少移植物抗宿主?。╣raft-versus-host disease，GVHD）的發(fā)生[1-3]；在實(shí)體瘤（如腎細(xì)胞癌、黑色素瘤）也有裂解腫瘤細(xì)胞的抗實(shí)體瘤作用。故輸注供者異源反應(yīng)性NK細(xì)胞已經(jīng)成為臨床移植及抗腫瘤輔助治療的新策略[4，5]。但外周血中NK細(xì)胞含量少，目前尚缺乏有效的體外擴(kuò)增體系。

2、本研究目的在于探討從人外周血中分選及擴(kuò)增高純度NK細(xì)胞的方法，尤其是自體Dcs作為飼養(yǎng)細(xì)胞的可行性及效果，并對(duì)擴(kuò)增后NK細(xì)胞功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期篩選出有效的NK細(xì)胞體外擴(kuò)增方法，為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 材料和方法：先采用miniMACS免疫磁珠分選方法，從外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMNC）得到純化的CD14+單核細(xì)胞及NK細(xì)胞，隨后體外經(jīng)GM-CSF及IL4誘導(dǎo)單核細(xì)胞5天，成為非成熟DCs。在干細(xì)胞培養(yǎng)基條件下，NK細(xì)胞

3、經(jīng)IL2和IL15培養(yǎng)5天后，培養(yǎng)體系中加入不同比例的DCs，根據(jù)與DC混合的比例及方式將培養(yǎng)體系分為5組：A組：NK/DC=10:1，B組：NK/DC=5:1；C組：NK/DC=2:1，D組：NK/DC=1:1 transwell非接觸共培養(yǎng)，E組（對(duì)照組）：不加DC。培養(yǎng)15天，每3天半量換液并補(bǔ)充細(xì)胞因子；檢測(cè)分選及擴(kuò)增前后（CD3-CD56+）NK細(xì)胞含量、擴(kuò)增倍數(shù)及擴(kuò)增前后各組NK細(xì)胞功能的變化（從以下三方面進(jìn)行）：在不同效靶

4、比下對(duì)K562細(xì)胞的殺傷作用；tealtime-PCR方法定量檢測(cè)IFN-γ、穿孔素、顆粒酶B mRNA的表達(dá)水平；流式檢測(cè)NK細(xì)胞表面KIR3DL1、NKG2D表達(dá)的變化，并探尋可能的miRNA調(diào)控機(jī)制。
　　 結(jié)果：（1）經(jīng)miniMACS陰性免疫磁珠分選后（CD3-CD56+）NK細(xì)胞含量由分選前的11.19±5.25％提高到94.23±3.50％。培養(yǎng)15天后除C組NK細(xì)胞純度略有下降外，其余四組與擴(kuò)增前無(wú)顯著性差異（P

5、>0.05）；（2）在各培養(yǎng)體系中A、B、C、D組細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)分別為168±64.4、170.5±82.6，244.8±148，和70.8±17.5，均顯著高于對(duì)照組（未加DCs）的50.46±4.3（P<0.01）：（3）培養(yǎng)后NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性呈A組≈B組（P>0.05）>C組>D組>E組（P<0.05）。（4）各擴(kuò)增體系NK細(xì)胞IFN-γ、Perforin及Granzyme B基因的表達(dá)量均較擴(kuò)增前（NKO組）明顯

6、增加（P<0.01）。（5）細(xì)胞因子擴(kuò)增后CD158e+的細(xì)胞下降約10％（P<0.05）。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示miR-146b可與KIR3DL13'UTR在靶位點(diǎn)特異結(jié)合，很有可能調(diào)控KIR3DL1的基因表達(dá)。
　　 結(jié)論：經(jīng)miniMACS免疫磁珠陰性分選得少量高純度NK細(xì)胞后，在含IL2（200U/mL）+IL15（20ng/mL）的SCGM（含5％人AB血清的）培養(yǎng)條件下，以人外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)的未成熟DC作為飼養(yǎng)細(xì)胞，