血漿Exosomes小體對Treg細(xì)胞功能的影響及B細(xì)胞體外擴(kuò)增Treg細(xì)胞的初步研究.pdf

1、目的：
　　1.通過將人血漿Exosomes小體、重組wnt分子分別與人外周血CD4+CD25+CD127loW調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(RegulatoryTCells，Treg)作用，觀察Treg細(xì)胞在體外的存活情況及其Wnt信號通路的變化。
　　2.通過將同種異基因人外周血B淋巴細(xì)胞體外擴(kuò)增Treg細(xì)胞，觀察Treg細(xì)胞擴(kuò)增前后在數(shù)量上的變化及表型和功能是否改變，建立體外擴(kuò)增Treg細(xì)胞的有效方法，并與樹突細(xì)胞(dendritic

2、cell，DC)擴(kuò)增Treg細(xì)胞的方法相比較。
　　方法：
　　1.應(yīng)用免疫磁珠分離方法分離純化人外周血CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞，將Wnt分子和從多個健康供者血漿中分離得到的Exosomes小體分別加入到Treg細(xì)胞中，加入人白介素2(IL-2，50U/ml)。利用RT-MR檢測共培養(yǎng)12h后Wnt信號通路涉及的凋亡相關(guān)基因的改變，同時采用流式技術(shù)檢測wnt信號通路中磷酸化β-catenin水平的改變，

3、并在共培養(yǎng)14天后采用流式技術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡情況。設(shè)立未經(jīng)處理的Treg細(xì)胞組為對照組。
　　2.將異體健康供者外周血分離得到的B淋巴細(xì)胞與磁珠分選得到的Treg細(xì)胞共孵育，用IL-2(100U/ml)和CD28單抗(500ng/ml)共同刺激，在培養(yǎng)14天的過程中通過流式檢測Treg細(xì)胞表型的變化，同時與樹突狀細(xì)胞擴(kuò)增Treg細(xì)胞的方法相比較(培養(yǎng)條件相同)。14天培養(yǎng)結(jié)束后，將細(xì)胞與CFSE處理過的經(jīng)強(qiáng)刺激(加入CD3單抗

4、500ng/ml，IL-2300U/ml)的CD4+效應(yīng)性T細(xì)胞共培養(yǎng)，在第五天通過流式檢測Treg細(xì)胞對CD4+T細(xì)胞的增殖抑制，設(shè)立只經(jīng)強(qiáng)刺激的CFSE處理過的CD4+T細(xì)胞為對照組。
　　結(jié)果：
　　1.通過RT-MR分析純化的Treg細(xì)胞上的Frizzled(FRZ)受體及低密度脂蛋白相關(guān)蛋白5(LRP5)和LRP6的基因表達(dá)，結(jié)果顯示Treg細(xì)胞表達(dá)FRZ2、3、4，LRP6基因，通過WesternBlotting

5、技術(shù)檢測血漿中Exosomes小體上Wnt3a和Wnt5a的蛋白表達(dá)，均有條帶出現(xiàn)。共培養(yǎng)12h后，RT-PCR檢測凋亡相關(guān)基因Bcl-xL、Bcl-2、c-Myc的表達(dá)，結(jié)果顯示Treg細(xì)胞與血漿exosomes樣小體或Wnt分子共培養(yǎng)時，抗凋亡基因Bcl-2相對于對照組均有明顯的上調(diào)，另一抗凋亡基因Bcl-xL和誘導(dǎo)凋亡的基因c-Myc無明顯變化。培養(yǎng)14天后，通過流式檢測凋亡，加入Exosomes樣小體或Wnt分子的Treg細(xì)胞生

6、存率均比對照組高。
　　2.經(jīng)B細(xì)胞聯(lián)合IL-2和CD28單抗刺激的Treg細(xì)胞在培養(yǎng)14天后流式檢測Foxp3和CD4/CD25，陽性率均很高，此時計數(shù)Treg細(xì)胞為最初數(shù)量的20倍。利用CFSE檢測技術(shù)，將擴(kuò)增14天的Treg細(xì)胞與CD3單抗和IL-2強(qiáng)刺激的CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，5天后流式檢測，擴(kuò)增后的Treg細(xì)胞能夠有效地抑制CD4+T細(xì)胞的增殖功能。
　　結(jié)論
　　1.初步判斷Wnt信號通路能夠影響Treg細(xì)

7、胞的生存狀態(tài)，血漿Exosomes小體能夠延長Treg細(xì)胞的生存時間，其中Exosomes小體攜帶Wnt分子與Treg細(xì)胞上的Frizzled受體作用可以活化Treg細(xì)胞的Wnt信號通路，在提高Treg細(xì)胞的生存率方面起了一定的作用，即血漿Exosomes小體可能通過Wnt信號通路途徑影響Treg細(xì)胞的存活。
　　2.同種異基因B淋巴細(xì)胞能夠在體外有效的擴(kuò)增人外周血Treg細(xì)胞，擴(kuò)增效率可達(dá)20倍以上，并且能顯著抑制CD4+T細(xì)胞