Herceptin對(duì)NK細(xì)胞體外擴(kuò)增和殺傷活性的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:觀察IL-2+IL-15 NK細(xì)胞體外大規(guī)模培養(yǎng)對(duì)于不同細(xì)胞亞群的細(xì)胞表型、細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)、細(xì)胞表面活化受體及腫瘤細(xì)胞殺傷活性的影響，并初步探討其作用機(jī)制。在此基礎(chǔ)上加入Herceptin，通過比較Herceptin在NK細(xì)胞體外大規(guī)模培養(yǎng)過程中對(duì)于細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)、細(xì)胞表型、細(xì)胞表面活化受體表達(dá)、靶細(xì)胞殺傷、細(xì)胞因子分泌及粘附等方面的影響，探討Herceptin在NK細(xì)胞體外大規(guī)模擴(kuò)增過程中對(duì)于不同細(xì)胞亞群生物學(xué)特點(diǎn)的影響及具體作用機(jī)

2、制。
　　方法:收集2012年2月至2013年3月期間天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院生物治療科乳腺癌患者外周血30例，用Ficoll法獲取PBMC。首先，用方案1（IL-2+IL-15）NK細(xì)胞體外擴(kuò)增方案進(jìn)行培養(yǎng)。觀察培養(yǎng)15d后的細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)、淋巴細(xì)胞亞群比例變化。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞免疫表型、細(xì)胞表面活化受體的表達(dá)。LDH釋放法和CD107a檢測(cè)不同細(xì)胞亞群對(duì)于HLA匹配或不匹配的靶細(xì)胞系的殺傷活性。在此基礎(chǔ)之上，分別用2種NK細(xì)胞

3、體外大規(guī)模擴(kuò)增方案進(jìn)行培養(yǎng):方案1（IL-2+IL-15）和方案2（Herceptin+IL-2+IL-15）。在體外培養(yǎng)過程的第0，5，10，15d分別通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)各個(gè)細(xì)胞亞群表型及細(xì)胞表面活化受體的變化。流式細(xì)胞儀檢測(cè)體外培養(yǎng)15d后擴(kuò)增倍數(shù)、NK細(xì)胞、CD3+CD56+NKT以及T細(xì)胞亞群比例。LDH釋放法和CD107a檢測(cè)不同方案擴(kuò)增產(chǎn)物以及各個(gè)細(xì)胞亞群對(duì)于K562細(xì)胞系及多種靶細(xì)胞系(T47D、MDA-MB-231、SK

4、BR3、SKOV3、A549)的殺傷能力和作用機(jī)制。活細(xì)胞工作站檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物殺傷不同的靶細(xì)胞時(shí)，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞之間粘附的情況。Elisa法檢測(cè)不同方案擴(kuò)增產(chǎn)物殺傷多種靶細(xì)胞系時(shí)細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α和TGF-β分泌量的變化。
　　結(jié)果:在體外擴(kuò)增15d之后，方案1、2的總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)分別為37.6±2631，44.82±6.84; NK細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)分別為89.60±57.17，102.81±94.06; CD3+CD5

5、6+NKT的擴(kuò)增倍數(shù)257.01±149.73，362.74±208.86;T的擴(kuò)增倍數(shù)37.18±16.84，43.20±14.75。方案1（IL-2+IL-15）體外擴(kuò)增NK細(xì)胞時(shí)，NK細(xì)胞表面活化受體NKp30、NKp44、NKG2D升高，CD16降低具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);CD3+CD56+NKT細(xì)胞表面活化受體DNAM-1和NKG2D升高(P＜0.05);T細(xì)胞表面活化受體變化與CD3+CD56+NKT細(xì)胞相似，DNA

6、M-1和NKG2D表達(dá)升高(P＜0.05)。方案1中總擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)于HLA-A不匹配的靶細(xì)胞系殺傷活性顯著高于殺傷HLA-A匹配的靶細(xì)胞系時(shí)的殺傷活性(P＜0.05)。方案2中Herceptin加入對(duì)于其總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)以及各細(xì)胞亞群擴(kuò)增倍數(shù)的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是可以明顯提高擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)于各種靶細(xì)胞系的殺傷活性，尤其是對(duì)于HLA不匹配但HER2+的靶細(xì)胞系的殺傷作用明顯(P＜0.05)。對(duì)于各個(gè)細(xì)胞亞群的細(xì)胞表型和細(xì)胞表面活化受體，與方案1

7、相比，方案2中NK細(xì)胞表面活化受體NKp44的表達(dá)升高[（68.83±12.89）％vs（86.95±7.18）％，P＜0.05]。同時(shí)，方案2中NK細(xì)胞以及CD3+CD56+NKT細(xì)胞對(duì)于HLA不匹配但是HER2+的靶細(xì)胞系的粘附作用明顯提高（P＜0.05）。方案2中擴(kuò)增產(chǎn)物殺傷腫瘤細(xì)胞時(shí)IFN-γ和TNF-α的分泌量增加，TGF-β的分泌降低（P＜0.05）。
　　結(jié)論:方案1（IL-2+IL-15）不僅具有擴(kuò)增NK細(xì)胞的作用

8、，同時(shí)具有擴(kuò)增CD3+CD56+NKT細(xì)胞的作用，具有顯著增強(qiáng)的非MHC限制性的抗腫瘤殺傷作用?？梢酝ㄟ^提高各細(xì)胞亞群表面活化受體的表達(dá)，來提高其擴(kuò)增產(chǎn)物的殺瘤活性。方案2（IL-2+IL-15+Herceptin）在保證總擴(kuò)增倍數(shù)和NK擴(kuò)增倍數(shù)的基礎(chǔ)上，提高細(xì)胞表面活化受體NKp44的表達(dá)，提高擴(kuò)增產(chǎn)物殺傷各種腫瘤細(xì)胞系時(shí)效靶細(xì)胞之間的粘附作用，以及細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α的分泌并降低TGF-β的分泌，從而提高擴(kuò)增產(chǎn)物的殺瘤活性