光刺激對新生小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育的影響及基質(zhì)糖蛋白Lumican異位表達(dá)的意義.pdf

1、小鼠出生時瞼裂是閉合的，這為其相對幼稚的視網(wǎng)膜出生后的繼續(xù)發(fā)育成熟提供了生理性的黑暗環(huán)境。我們通過人工開啟單側(cè)眼瞼的方法，利用C57BL/6J(黑色近交系)小鼠成功建立了過早接受形覺刺激的動物模型，為研究過早光照對視網(wǎng)膜發(fā)育的影響提供了較理想的動物模型。前期工作表明，過早光刺激可引發(fā)小鼠可逆性的非軸性近視，并伴隨視網(wǎng)膜組織中Lumican基因轉(zhuǎn)錄活性的顯著性激活。本研究在CD1(白色遠(yuǎn)交系)小鼠中重建并優(yōu)化了這一模型，詳細(xì)量化過早光照引

2、發(fā)的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的發(fā)育異常，描述了Lumican異位表達(dá)的時間空間分布情況以及相應(yīng)區(qū)域細(xì)胞生長與EMT狀態(tài)的變化。實驗從細(xì)胞與分子水平為探討提前光照影響視網(wǎng)膜發(fā)育的病理機(jī)制、解析過早光刺激與MOP發(fā)生的關(guān)聯(lián)提供了佐證。
　　 課題主要的研究方法和內(nèi)容如下：
　　 (1)優(yōu)化過早光刺激小鼠模型，選擇CD1新生小鼠替代原有的C57BL/6J作為實驗動物，一方面提高了新生小鼠出身率與健康存活比率，更為重要的是，為基于CD1遺傳背

3、景的Lumican基因敲除小鼠的引進(jìn)和深入的機(jī)理研究提供可能，實驗要求嚴(yán)格杜絕對照眼球的意外感光。我們選擇P4作為開瞼時間，鈍性開啟右側(cè)眼瞼(記為實驗眼，R)，以左側(cè)眼球為自身對照(L)。采集P6、P9、P12時間點的眼球制作冰凍切片或于對應(yīng)時間點抽提視網(wǎng)膜組織總蛋白、總RNA，觀察、量化不同時間點新生小鼠視網(wǎng)膜各個核層的細(xì)胞增殖與凋亡水平，分析提前光照對視網(wǎng)膜發(fā)育影響的時間空間特性。
　　 (2)觀察上述三個時間點視網(wǎng)膜中Lu

4、mican在mRNA與蛋白水平上的異位表達(dá)和分布情況；比較在該糖蛋白異常積蓄的時期，相關(guān)視網(wǎng)膜細(xì)胞增殖、凋亡和EMT的變化，為全面而深入分析該基因的蛋白產(chǎn)物影響神經(jīng)發(fā)育的潛在機(jī)制提供第一手實驗數(shù)據(jù)。
　　 主要結(jié)果與結(jié)論如下：
　　 (1)過早光刺激對視網(wǎng)膜細(xì)胞生長狀態(tài)的影響H-E染色顯示，光刺激對內(nèi)、外網(wǎng)層及視桿視錐的發(fā)育進(jìn)程并不產(chǎn)生顯著性影響，卻能明顯的改變視網(wǎng)膜細(xì)胞的數(shù)量：P6-P9時期可促進(jìn)內(nèi)、外核層與節(jié)細(xì)胞數(shù)量

5、的維持，P10-P12則轉(zhuǎn)而加劇細(xì)胞數(shù)量的減少。據(jù)此，我們將光刺激影響視網(wǎng)膜發(fā)育的時相分作早期的生長促進(jìn)期(P6-P9)與晚期的生長抑制期(P10-P12)。
　　 (2)過早光刺激對視網(wǎng)膜細(xì)胞增殖水平的抑制以PCNA為細(xì)胞增殖指標(biāo)，量化視網(wǎng)膜細(xì)胞的增殖狀態(tài)。感光細(xì)胞增殖活力受過早光刺激的抑制最為敏感，在P9時，ONL中零散分布于邊緣區(qū)域的PCNA核內(nèi)熒光信號完全消失，但該異常刺激卻并不能改變生長促進(jìn)期(P6-P9)視網(wǎng)膜細(xì)胞的

6、總體增殖狀態(tài)。進(jìn)入生長抑制期(P10-P12)之后，光刺激對細(xì)胞增殖水平的抑制效應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)展到INL中間神經(jīng)元，節(jié)細(xì)胞在P12時生理性的PCNA再度上揚(yáng)現(xiàn)象在實驗眼視網(wǎng)膜中被徹底抑制，視網(wǎng)膜細(xì)胞總體增殖水平呈顯著性的低下，僅極少數(shù)細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)出微弱的PCNA陽性信號。
　　 (3)過早光刺激對視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡水平的影響TUNEL染色分析視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡狀態(tài)。生理狀態(tài)下，內(nèi)外核層細(xì)胞凋亡峰值形成時間不同：ONL細(xì)胞凋亡高峰出現(xiàn)在P1

7、2(自然睜眼前)，而INL則發(fā)生在P6前后。光照可全程抑制感光細(xì)胞的凋亡；對視網(wǎng)膜INL細(xì)胞凋亡的影響相對復(fù)雜：于生長促進(jìn)期(P6-P9)抑制中間神經(jīng)元凋亡，于生長抑制期(P10-P12)則明顯延滯INL細(xì)胞凋亡水平的迅速下滑。
　　 綜上所述，光刺激在生長促進(jìn)期(P6-P9)，主要通過抑制神經(jīng)視網(wǎng)膜(INL+ONL)細(xì)胞早期(P6時)凋亡峰的形成、導(dǎo)致大量的細(xì)胞存活，從而引起這一時期細(xì)胞數(shù)量的增多。P12時，盡管光照對感光細(xì)胞

8、與中間神經(jīng)元的凋亡施加了截然相反的影響，但在此時刻，實驗眼INL細(xì)胞的增殖活力卻極度減弱，加之節(jié)細(xì)胞的PCNA峰未能出現(xiàn)，故生長抑制期(P10-P12)期間，光刺激主要通過對細(xì)胞增殖的全面抑制效應(yīng)來實現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量的回落。
　　 (4)過早光刺激誘導(dǎo)視網(wǎng)膜中Lumican的表達(dá)Lumican主要由間充質(zhì)來源的細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞、角膜細(xì)胞)合成，在視網(wǎng)膜、腦等外胚層起源的神經(jīng)器官組織中表達(dá)低下。光照引發(fā)視網(wǎng)膜中Lumican轉(zhuǎn)錄水平的

9、激活始發(fā)自P9，于P12達(dá)高峰，睜眼后迅速回落，至P21重新恢復(fù)沉寂。P9時，極其微量的Lumican蛋白產(chǎn)物可在視網(wǎng)膜組織總蛋白提取液中檢出，以后其含量急劇增多，P12時可見65kDa的寬幅蛋白條帶--視網(wǎng)膜中表達(dá)的Lumican是糖蛋白而非KSPG。P12時，Lumican糖蛋白主要分布在外網(wǎng)層以內(nèi)的神經(jīng)組織中，這包括：內(nèi)外網(wǎng)層、INL與GCL，主要影響中間神經(jīng)元與節(jié)細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)化行為。
　　 (5)Lumican異位表達(dá)

10、與相關(guān)細(xì)胞增殖水平的抑制以PCNA為細(xì)胞增殖指標(biāo)，對P9和P12時的INI與GCL的細(xì)胞增殖狀態(tài)進(jìn)行了進(jìn)一步的量化。隨著Lumican在神經(jīng)視網(wǎng)膜INL與GCL中的蓄積，相應(yīng)區(qū)域新生細(xì)胞數(shù)量銳減明顯，這一方面體現(xiàn)在P12時(Lumican異常蓄積高峰時刻)INL細(xì)胞PCNA核內(nèi)信號顯著性減少，一方面表現(xiàn)為GCL中PCNA上揚(yáng)現(xiàn)象的完全消失。
　　 (6)Lumican異位表達(dá)與相關(guān)細(xì)胞凋亡水平的維持為了準(zhǔn)確評價視網(wǎng)膜INL與GC

11、L細(xì)胞的凋亡狀態(tài)，我們選擇了Caspase-939kDa活性肽段--p39作為細(xì)胞凋亡量化指標(biāo)。免疫熒光檢測證實，Caspase-9標(biāo)記的細(xì)胞分布在視網(wǎng)膜(INL+GCL)核層中，而ONL中未見熒光信號；Western-blot確證該分子在這兩個核層中的存在形式主要是p39活性肽段，未見全長(49kDa)條帶出現(xiàn)，說明此抗體可以特異性標(biāo)記INL與GCL中的凋亡細(xì)胞。隨著Lumican在視網(wǎng)膜中的聚集，P12時相對于對照組細(xì)胞凋亡水平的進(jìn)

12、行性銳減，實驗眼視網(wǎng)膜Caspase-9 p39依舊維持在相對較高的水平，說明光刺激可于生長抑制期(P10-P12)引發(fā)這兩個核層細(xì)胞較為明顯的凋亡。
　　 綜合上述結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，隨著Lumican糖蛋白在神經(jīng)視網(wǎng)膜內(nèi)側(cè)區(qū)域的積蓄，相應(yīng)分布區(qū)域的視網(wǎng)膜細(xì)胞表現(xiàn)出增殖活性的銳減與凋亡水平的相對維持，其綜合效應(yīng)將導(dǎo)致(INL+GCL)細(xì)胞生長活性的減低、細(xì)胞數(shù)量的減少。這一發(fā)現(xiàn)揭示了，Lumican可能參與了光刺激對生長抑制期間(P

13、10-P12)相關(guān)核層細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)。參考Lumican對間充質(zhì)來源細(xì)胞(如角膜細(xì)胞)具有抑增殖促凋亡的調(diào)控作用，我們據(jù)此推測，該分子對來源于神經(jīng)上皮的視網(wǎng)膜細(xì)胞也有相似的作用。正是由于光刺激引發(fā)Lumican轉(zhuǎn)錄水平的激活以及其糖蛋白產(chǎn)物在P9-P12的迅速蓄積，導(dǎo)致相同的刺激對不同時期的視網(wǎng)膜(尤其是INL與GCL)發(fā)育產(chǎn)生截然相反的影響--由前期的促進(jìn)生長轉(zhuǎn)入后期持續(xù)的抑制。
　　 (7)Lumican異位表達(dá)與EMT值得

14、我們注意的是，光照并非立即誘發(fā)Lumican在視網(wǎng)膜中的異常表達(dá)。而上皮細(xì)胞盡管在特殊應(yīng)激誘發(fā)(如損傷)下，可以重新開啟Lumican的合成潛力，但通常需經(jīng)歷EMT，且Lumican異位表達(dá)后還可以進(jìn)一步維持這種異常轉(zhuǎn)化狀態(tài)。以α-SMA作為EMT量化指標(biāo)、分析P6、P9、P12時間點視網(wǎng)膜EMT狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)光刺激可引發(fā)P6時α-SMA在視網(wǎng)膜中的廣泛提升以及P9時(INL+GCL)中α-SMA的富集效應(yīng)，提示Lumican的表達(dá)繼發(fā)于光