Liver X receptorβ對小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育和視覺功能的影響及機(jī)制研究.pdf

1、肝臟X受體（Liver X receptors，LXRs）是在哺乳動物體內(nèi)廣泛分布的核受體家族成員，主要分為兩種亞型:LXRα(NR1H3)和LXRβ(NR1H2)，前者主要分布于肝臟、小腸、胰腺等脂類代謝相關(guān)器官，后者則主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)。LXRs在調(diào)節(jié)膽固醇代謝和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)板層結(jié)構(gòu)發(fā)育以及阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）和帕金森?。≒arkinson's dis

2、ease，PD）等神經(jīng)退行性疾病的病理生理過程。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的延續(xù)，視網(wǎng)膜同樣也高表達(dá)LXRβ，但該受體在視網(wǎng)膜發(fā)育和視功能中所起的作用尚不清楚。
　　既往研究發(fā)現(xiàn)，LXRβ敲除可以通過影響放射狀膠質(zhì)細(xì)胞(Radial glial cells，RGCs)的長纖維形成而阻礙大腦皮層新生神經(jīng)元的“內(nèi)向外”(inside out)的放射狀遷移，導(dǎo)致大腦皮質(zhì)板層發(fā)育障礙。Müller細(xì)胞被認(rèn)為是位于視網(wǎng)膜中的特殊放射狀膠質(zhì)細(xì)胞，在視網(wǎng)

3、膜的發(fā)育中起著十分重要的功能。研究表明，在視網(wǎng)膜發(fā)育過程中特異性損傷Müller細(xì)胞可導(dǎo)致視網(wǎng)膜感光細(xì)胞異位分布。離體實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，與Müller細(xì)胞共培養(yǎng)的視網(wǎng)膜細(xì)胞球可以恢復(fù)正常的板層結(jié)構(gòu)，并形成排列規(guī)則的感光細(xì)胞層，而無Müller細(xì)胞共培養(yǎng)的感光細(xì)胞球則形成大量的“玫瑰花結(jié)”樣結(jié)構(gòu)，提示Müller細(xì)胞在視網(wǎng)膜板層結(jié)構(gòu)建立中同樣也起著十分重要的作用，可能發(fā)揮類似于中樞神經(jīng)系統(tǒng)板層構(gòu)筑中的RGCs作為支架引導(dǎo)新生神經(jīng)元的遷移的作用。

4、
　　成年視網(wǎng)膜中Müller細(xì)胞對維持內(nèi)層視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)十分重要，主要參與了神經(jīng)視網(wǎng)膜中神經(jīng)遞質(zhì)包括興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸、抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸等的清除和代謝。Müller細(xì)胞還參與了內(nèi)層視網(wǎng)膜的水鹽代謝、視網(wǎng)膜血流和視網(wǎng)膜糖代謝的調(diào)節(jié)。其中，在調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜中谷氨酸穩(wěn)態(tài)時，特異性表達(dá)于Müller細(xì)胞內(nèi)的谷氨酰胺合成酶（glutaminesynthetase， GS）在“谷氨酸-谷氨酰胺”循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。GS表達(dá)量及活性將直

5、接影響到Müller細(xì)胞清除內(nèi)核層（inner nuclear layer，INL）中谷氨酸的速率，GS表達(dá)量的下調(diào)將引起細(xì)胞外谷氨酸含量增加，導(dǎo)致興奮性神經(jīng)毒性作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，GS的下調(diào)與視網(wǎng)膜電圖（electroretinogram，ERG）的功能變化呈正相關(guān)。在視網(wǎng)膜變性時，Müller細(xì)胞往往過度活化，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量以及表達(dá)標(biāo)志物的改變，此時Müller細(xì)胞對視網(wǎng)膜的調(diào)節(jié)作用受到影響。在一定條件下，M訌ller細(xì)胞又可

6、作為潛在的內(nèi)源性視網(wǎng)膜干細(xì)胞，可分化產(chǎn)生視網(wǎng)膜中的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。這一特點(diǎn)與位于大腦以及小腦中的RGCs一致。LXRβ對成年小鼠視網(wǎng)膜中的Müller細(xì)胞和視覺功能有何影響，目前尚無文獻(xiàn)報道。
　　LXRs具有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的作用，該調(diào)節(jié)作用與其抑制小膠質(zhì)細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在LXRβ-/-小鼠的黑質(zhì)部位多巴胺神經(jīng)元丟失明顯多于野生小鼠，而活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞在LXRβ-/-小鼠黑質(zhì)

7、中明顯增加。在AD模型中，LXRs激動劑可以抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞的活化，減緩AD的進(jìn)展。因此，LXRs可以通過抑制神經(jīng)退行性疾病中的膠質(zhì)活化，減少神經(jīng)元丟失。視網(wǎng)膜變性時也存在膠質(zhì)細(xì)胞的增生，增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferativevitreoretinopathy，PVR)以及增殖性的糖尿病性視網(wǎng)膜病變(proliferative diabeticretinopathy，PDR)時，Müller細(xì)胞即發(fā)生增殖及纖維化，于玻璃

8、體下腔中形成“膠質(zhì)封閉”，影響視網(wǎng)膜修復(fù)。LXRs的激活是否可以減輕病理狀態(tài)下視網(wǎng)膜中炎癥反應(yīng)和膠質(zhì)增生目前還不清楚。在酒精致視網(wǎng)膜損傷的動物模型中常?？捎^察到增強(qiáng)的膠質(zhì)細(xì)胞活化，以及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、雙極細(xì)胞、水平細(xì)胞等細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞形態(tài)的改變。因此，我們采用此種動物模型來研究LXRs對損傷狀態(tài)下視網(wǎng)膜的影響及可能機(jī)制。
　　因此，本研究提出如下假設(shè):在發(fā)育階段和成年階段，LXRβ通過影響視網(wǎng)膜中Müller細(xì)胞功能而影響小鼠視網(wǎng)膜結(jié)

9、構(gòu)及功能。激活LXRs可減輕酒精損傷新生小鼠視網(wǎng)膜的膠質(zhì)細(xì)胞激活和神經(jīng)元丟失。
　　本文的主要研究結(jié)果如下:
　　1.LXRβ對新生小鼠視網(wǎng)膜板層構(gòu)筑的影響
　　采用HE染色、BrdU標(biāo)記，免疫組化等技術(shù)，觀察LXRβ-/-小鼠和同齡的野生型小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果顯示:出生后7天，LXRβ-/-小鼠的視網(wǎng)膜內(nèi)核層(INL)較同齡野生小鼠INL顯著增厚(p＜0.01)。BrdU陽性細(xì)胞分析結(jié)果顯示，LXRβ敲除后并不影

10、響視網(wǎng)膜神經(jīng)元的增殖能力。LXRβ-/-小鼠視網(wǎng)膜INL中BLBP陽性細(xì)胞較同齡的野生小鼠顯著增多，而ONL中BLBP陽性細(xì)胞減少。
　　2.成年LXRβ-/-小鼠和同齡野生小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)及視功能研究
　　通過檢測3月齡、7月齡、10月齡雄性LXRβ-/-和同齡野生小鼠的暗適應(yīng)ERG，發(fā)現(xiàn)LXRβ-/-小鼠ERG-a波和ERG-b波幅值均較同齡野生小鼠幅值顯著降低(p＜0.01)，而a、b波的潛伏期無明顯差異(p＞0.05)

11、。免疫組化及Western-blot檢測發(fā)現(xiàn):LXRβ-/-小鼠Müller細(xì)胞終足部位GS的表達(dá)較野生小鼠明顯減弱(p＜0.05)，全視網(wǎng)膜GS表達(dá)也較野生小鼠顯著減少(p＜0.01)。LXRβ-/-小鼠PKC-α陽性雙極細(xì)胞和PKC-α蛋白水平明顯降低(p＜0.05)。而感光細(xì)胞標(biāo)記Rhodopsin免疫組化及WB結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)LXRβ-/-和同齡野生小鼠之間有明顯差異(p＞0.05)。
　　3.LXRs激動劑對酒精視網(wǎng)膜損傷小

12、鼠模型的保護(hù)作用研究
　　為進(jìn)一步證實(shí)LXRs在視網(wǎng)膜中的作用，采用酒精暴露致視網(wǎng)膜損傷的新生小鼠模型，通過HE染色和免疫組織化學(xué)法進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn):出生后6天(P6)時酒精可導(dǎo)致視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層中細(xì)胞數(shù)量減少(p＜0.01)。酒精暴露新生小鼠視網(wǎng)膜GCL中NeuN陽性細(xì)胞數(shù)較對照組明顯減少(p＜0.01)，酒精暴露組與T0預(yù)處理組相比，NeuN陽性細(xì)胞也明顯減少(p＜0.05)。酒精暴露組GFAP表達(dá)較對照組明顯增加(p＜0.01)，

13、酒精暴露組與T0預(yù)處理組相比，GFAP表達(dá)也明顯減少(p＜0.05)。出生后10天(P10)時，視網(wǎng)膜切片HE染色、NeuN和GFAP結(jié)果趨勢與P6時相同，即酒精處組GCL中細(xì)胞密度以及NeuN陽性細(xì)胞較對照組和T0預(yù)處理組明顯減少。P10發(fā)現(xiàn)酒精暴露小鼠GS表達(dá)量和PKC-α陽性細(xì)胞數(shù)均較對照組下降，而提前給予激動劑可以減輕酒精的這一作用。
　　結(jié)論:
　　1.LXRβ敲除導(dǎo)致新生小鼠(P7)視網(wǎng)膜中Müller成熟延遲，