根皮苷對db-db小鼠視網(wǎng)膜保護(hù)機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分根皮苷對db/db小鼠視網(wǎng)膜保護(hù)作用的研究
　　 研究背景:
　　 糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種由于胰島素抵抗伴有相對胰島素不足或胰島素分泌的缺陷而導(dǎo)致的以慢性血葡萄糖水平增高為特征的代謝性疾病。近年來，隨著生活水平的提高、生活方式的改變以及人口的老齡化，DM的患病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)逐步增高的趨勢，業(yè)已成為嚴(yán)重威脅人類生命健康與生活質(zhì)量的世界性公共衛(wèi)生問題。
　　 DM不僅僅表

2、現(xiàn)為持續(xù)的血糖代謝紊亂，更重要的是其可以導(dǎo)致機(jī)體大血管與微血管的嚴(yán)重?fù)p害。DM視網(wǎng)膜病變是DM微血管病變最常見的并發(fā)癥之一，也是最為嚴(yán)重的DM眼部并發(fā)癥。幾乎所有的1型DM與超過半數(shù)的2型DM患者最終均會發(fā)展并導(dǎo)致DM視網(wǎng)膜病變。在發(fā)達(dá)的工業(yè)化國家，DM的視網(wǎng)膜病變是成人中獲得性視力損害與失明的最重要的病因。與非DM人群比較，DM患者致盲的危險性升高25倍。由于DM流行趨勢的影響，近年來與DM伴行的DM視網(wǎng)膜病變同樣嚴(yán)重并備受重視。迄今

3、為止，針對DM視網(wǎng)膜病變的防治手段主要集中于代謝危險因素的控制（如嚴(yán)格控制血糖、血壓等）以及眼的局部治療（如藥物、激光與手術(shù)治療等）。然而，上述治療方法均受限于局部并發(fā)癥與治療效果的困擾，并不能完全阻斷視網(wǎng)膜病變的發(fā)展。因此，在臨床實踐中迫切需要尋找防治DM視網(wǎng)膜病變的新型藥物與途徑，旨在進(jìn)一步完善與充實DM視網(wǎng)膜病變的治療策略。
　　 根皮苷(phlorizin，PHL)是根皮素(phloretin)的2‘-β-D-葡萄糖苷，

4、屬于植物黃酮類中的二氫查爾酮苷。PHL作為蘋果多酚中的重要組分，主要存在于蘋果屬的多種植物中，在植物的根、莖、葉與果實中均有分布。大量研究結(jié)果表明，PHL具有多種生物活性與藥理作用，如抗炎，抗腫瘤，抗氧化，以及降低血糖與改善認(rèn)知等。近年來，PHL已經(jīng)作為新型的候選藥物應(yīng)用于DM血管并發(fā)癥的基礎(chǔ)研究中。動物實驗發(fā)現(xiàn)，PHL可以顯著改善InsAkitaDM小鼠的心室肥厚與心室重塑。PHL還可以明顯抑制db/db小鼠的主動脈病變與肝臟損害。還

5、有證據(jù)表明，在STD誘發(fā)的DM大鼠中，PHL可以顯著減少其蛋白尿，改善其腎小球的高濾過狀態(tài)。PHL的衍生物T-1095能夠明顯降低db/db小鼠的蛋白尿，提示PHL具有DM腎臟病變的保護(hù)作用。但是，PHL是否對于db/db小鼠視網(wǎng)膜病變具有保護(hù)作用，目前國內(nèi)外未見報道。本研究應(yīng)用目前較為普遍認(rèn)可的db/db小鼠作為2型DM的動物模型，采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測db/db小鼠視網(wǎng)膜中神經(jīng)元細(xì)

6、胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡特征，并檢測視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)變化以評價db/db小鼠視網(wǎng)膜的病變損傷。同時檢測糖原合成酶激酶3β(GSK3β)蛋白以及磷酸化糖原合成酶激酶3β(phospho-GSK3β)蛋白在視網(wǎng)膜組織的表達(dá)。本研究旨在觀察天然藥物PHL對于db/db小鼠視網(wǎng)膜病變的影響，初步并探討PHL實現(xiàn)其保護(hù)作用的可能分子機(jī)制，從為臨床上治療DM慢性血管并發(fā)癥提供新的治療思路與途徑。
　　 研究

7、目的:
　　 1.研究db/db小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡以及視網(wǎng)膜GFAP的表達(dá)等視網(wǎng)膜病變早期階段的特點;
　　 2.研究PHL對于db/db小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡與視網(wǎng)膜GFAP表達(dá)的影響，評價PHL對于db/db小鼠視網(wǎng)膜的保護(hù)作用;
　　 3.研究PHL對于GSK3β蛋白與phospho-GSK3β蛋白在視網(wǎng)膜組織表達(dá)的影響。初步探討PHL對db/db小鼠視網(wǎng)膜保護(hù)作用的機(jī)制，為開辟DM視網(wǎng)膜病變治療的新途徑完善

8、理論基礎(chǔ)。
　　 研究方法:
　　 7周齡雄性C57BLKS/J db/db小鼠16只，以及7周齡雄性C57BLKS/J db/m小鼠8只，均由南京大學(xué)模式動物研究所提供。正式實驗開始前所有小鼠均予觀察1周。實驗開始后分組，C57BLKS/J db/m小鼠8只作為正常對照組(CC)，C57BLKS/J db/db小鼠隨機(jī)分為兩組:一組隨機(jī)8只小鼠為DM模型組(DM)，每日予生理鹽水灌胃;另一組隨機(jī)8只為PHL干預(yù)組(DM

9、T)，PHL20mg/kg/d溶液灌胃（與DM組生理鹽水體積相同），共進(jìn)行10周。實驗期間每周定期測量體重(BW)并記錄。實驗周期結(jié)束，所有小鼠空腹過夜并處死。采血檢測空腹血糖(FBG)，糖基化終末代謝產(chǎn)物(AGEs)等指標(biāo)。并迅速摘除眼球，多聚甲醛固定后并常規(guī)分離視網(wǎng)膜，按照病理取材常規(guī)制作視網(wǎng)膜石蠟切片。然后應(yīng)用TUNEL法檢測視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況，并應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡(western blotting)技術(shù)分析GFAP蛋白、GSK3

10、β蛋白與phospho-GSK3β蛋白在視網(wǎng)膜組織的表達(dá)。部分視網(wǎng)膜組織分離后立即于液氮速凍后-80°保存留待進(jìn)一步蛋白質(zhì)組學(xué)實驗用。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.一般觀察
　　 CC組小鼠生長以及精神狀況良好，活躍，毛發(fā)光順。DM組小鼠實驗進(jìn)程中，逐漸表現(xiàn)為污穢無澤，被毛蓬松，少動，明顯多飲、多食、多尿，體重快速增加。DMT組小鼠上述表現(xiàn)有所改善。
　　 2.PHL對db/db小鼠體重、FBG與AGEs

11、的影響
　　 實驗開始DM組與DMT組的體重差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，但均顯著高于CC組(P＜0.01)。自實驗第2周開始，DM組小鼠體重逐漸增加，該趨勢一直持續(xù)至實驗結(jié)束（即實驗第10周）。然而，DMT組小鼠與DM組相比，體重表現(xiàn)為明顯下降(P＜0.01)。
　　 實驗開始時DM組與DMT組間的FBG與AGEs水平無顯著性差異(P＞0.05)，但與CC組比較，兩組FBG與AGEs水平均明顯升高(P＜0.05)

12、。給予PHL干預(yù)10周后，DMT組小鼠的FBG與AGEs水平與DM組比較則明顯降低(P＜0.05)。
　　 3.PHL對db/db小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的影響
　　 實驗結(jié)束后，于TUNEL法以及蘇木素-伊紅(HE)染色復(fù)染檢測小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡，以細(xì)胞核棕黃（褐）色染色結(jié)果判定為陽性細(xì)胞。三組實驗小組同樣條件下至少各計數(shù)10個視野的凋亡細(xì)胞，以凋亡細(xì)胞與細(xì)胞總數(shù)的比值表示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CC組小鼠視網(wǎng)膜未見明顯細(xì)胞凋亡，正常

13、細(xì)胞核在HE復(fù)染后呈藍(lán)色，細(xì)胞核形態(tài)、大小較一致。與CC組比較，DM組小鼠視網(wǎng)膜TUNEL-陽性細(xì)胞的數(shù)量顯著增加(P＜0.01)，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色或者棕褐色顆粒，細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，大小不一，且多位于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞。DMT組小鼠視網(wǎng)膜與DM組小鼠相比較，PHL治療后，其視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P＜0.01)。
　　 4.PHL對db/db小鼠視網(wǎng)膜GFAP表達(dá)的影響
　　 Western

14、blotting染色顯示，實驗結(jié)束時，CC組小鼠視網(wǎng)膜組織GFAP顯色反應(yīng)最弱，含量最低。DM組視網(wǎng)膜組織GFAP表達(dá)明顯增高，PHL治療后，GFAP表達(dá)則顯著降低，但仍明顯強(qiáng)于對照組。
　　 5.PHL對db/db小鼠視網(wǎng)膜GSK3β蛋白與phospho-GSK3β蛋白表達(dá)的影響
　　 Western blotting染色顯示，實驗結(jié)束時，與CC組小鼠視網(wǎng)膜組織phospho-GSK3β蛋白表達(dá)相比較，DM組視網(wǎng)膜組織

15、phospho-GSK3β蛋白表達(dá)明顯減少。經(jīng)PHL治療后，phospho-GSK3β蛋白表達(dá)則顯著增高。
　　 結(jié)論:
　　 1.與正常對照組比較，db/db小鼠隨年齡增長其體重顯著增加，PHL干預(yù)可以顯著改善db/db小鼠的肥胖。
　　 2.db/db小鼠的FBG與AGEs水平較正常對照組顯著升高，經(jīng)PHL治療后能夠顯著降低其FBG與AGEs水平。
　　 3.PHL治療可以顯著減少db/db小鼠視網(wǎng)膜

16、凋亡細(xì)胞的數(shù)量，抑制db/db小鼠視網(wǎng)膜組織GFAP的過量表達(dá)，提示PHL對于db/db小鼠視網(wǎng)膜的保護(hù)作用。
　　 4.PHL可以通過減少phospho-GSK3β蛋白表達(dá)，抑制GSK3β蛋白活性的途徑，減輕db/db小鼠視網(wǎng)膜的細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)其視網(wǎng)膜病變的作用。
　　 第二部分基于iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探討根皮苷對db/db小鼠視網(wǎng)膜的保護(hù)機(jī)制
　　 研究背景:
　　 人類基因組計劃的重大研

17、究成果——人類基因組序列圖譜的完成，宣告了生命科學(xué)研究已經(jīng)步入了一個新的紀(jì)元——“后基因組時代(postgenome era)”的到來。人們認(rèn)識到，基因僅僅只是遺傳信息的源頭與載體，而功能性蛋白才是基因功能的執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者。對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究將直接闡明生命在生理或病理狀態(tài)下的變化機(jī)制。然而，傳統(tǒng)的對單個蛋白質(zhì)進(jìn)行研究的方式已經(jīng)無法滿足功能基因組時代的要求。因此，必須需要在整體、動態(tài)、網(wǎng)絡(luò)的水平上進(jìn)行探討，才能揭示生

18、命現(xiàn)象的本質(zhì)。由此，蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)運而生，它是以細(xì)胞內(nèi)或是一種基因組的全部蛋白質(zhì)及其活動方式為研究對象?？梢哉f，蛋白質(zhì)組學(xué)研究的開展不僅是生命科學(xué)研究進(jìn)入后基因組時代的里程碑，也是后基因組時代生命科學(xué)研究的重點內(nèi)容之一。
　　 隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷深入與發(fā)展，人們已經(jīng)不再滿足于對一個混合體系中的蛋白質(zhì)進(jìn)行簡單的定性分析。蛋白質(zhì)組從靜態(tài)的定性分析發(fā)展到動態(tài)變化的定量研究，于是有學(xué)者提出“定量蛋白質(zhì)組學(xué)(quantitative

19、proteomics)”的概念。定量蛋白質(zhì)組學(xué)是功能蛋白質(zhì)組學(xué)中的重要內(nèi)容之一，就是把一個基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)或一個復(fù)雜的混合體系中所有蛋白質(zhì)進(jìn)行精確地定量與鑒定。定量蛋白質(zhì)組學(xué)著重于定量解析細(xì)胞蛋白質(zhì)的動態(tài)變化與動態(tài)行為，進(jìn)而真實的反映了細(xì)胞功能、過程機(jī)制等綜合信息。因此，定量蛋白質(zhì)組學(xué)常被用于分析疾病與健康、藥物處理前后蛋白質(zhì)中的差異蛋白的確定，并有助于發(fā)現(xiàn)新的生物功能、可用于鑒定診斷或預(yù)警的疾病標(biāo)志物和發(fā)現(xiàn)用于疾病治療的靶標(biāo)蛋白

20、質(zhì)。近年來該領(lǐng)域發(fā)展非常迅速，全新的應(yīng)用和方法設(shè)計正在不斷推進(jìn)著技術(shù)創(chuàng)新。近年來出現(xiàn)的一種基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析技術(shù)即同位素標(biāo)記的相對和絕對定量技術(shù)(isobaric tag for relative and absolute quantification，iTRAQ)以其獨特的優(yōu)越性，正逐漸成為定量研究中的主要方法之一。iTRAQ相對定量技術(shù)為開展針對特定細(xì)胞或狀態(tài)機(jī)制等的研究提供了一種差減分析的工具，最終可以提供上調(diào)或者下調(diào)蛋

21、白質(zhì)的功能信息，其將在探討疾病的發(fā)生機(jī)制、疾病標(biāo)志物的尋找、藥物靶標(biāo)的鑒定以及新藥的研發(fā)與利用等研究領(lǐng)域得到很好的應(yīng)用
　　 PHL是一種天然多酚類化合物，廣泛存在于蘋果屬的多種植物中。大量研究發(fā)現(xiàn)，PHL具有多種生物活性、藥理作用與臨床功效，如抗氧化損傷、清除自由基、調(diào)節(jié)血糖與血壓、保護(hù)心臟、抗腫瘤以及改善認(rèn)知等等。已有研究結(jié)果提示，PHL對于DM心肌肥厚、主動脈病變、腎臟蛋白尿、視網(wǎng)膜早期周細(xì)胞損傷等DM大血管與微血管病變具

22、有改善作用。本課題第一部分研究也發(fā)現(xiàn):PHL對于db/db小鼠視網(wǎng)膜具有明顯的保護(hù)作用。然而，目前尚未明確PHL保護(hù)DM視網(wǎng)膜病變的作用機(jī)制以及分子靶點。
　　 藥物研發(fā)的過程中需要特別重視藥物治療、蛋白質(zhì)表達(dá)和生理反應(yīng)之間存在的密切關(guān)系。絕大多數(shù)情況下，藥物治療會導(dǎo)致基因產(chǎn)物表達(dá)的調(diào)控與修飾。同樣，復(fù)雜的疾病過程如DM的代謝紊亂也會引起蛋白質(zhì)表達(dá)的改變。為此，可以推斷理想的藥物有能力將受擾系統(tǒng)的整體蛋白質(zhì)表達(dá)恢復(fù)至正常狀態(tài)的水

23、平。傳統(tǒng)意義上的藥物研究往往注重藥物表型的觀察與單個大分子或酶解的活性，無法實現(xiàn)對于藥物的藥理活性的檢測以及藥物作用的靶點的全面分析。隨著定量蛋白質(zhì)組學(xué)與藥學(xué)研究的共同發(fā)展與結(jié)合，為藥物高效率開發(fā)與利用帶來了新的希望。在實際應(yīng)用中，定量蛋白質(zhì)組學(xué)可以實現(xiàn)高通量的對比分析藥物作用前后蛋白質(zhì)表達(dá)譜或者蛋白質(zhì)表達(dá)豐度的改變，從而詳盡的闡明藥物的作用機(jī)制，并可以發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)藥物作用的靶點，揭示藥物作用環(huán)節(jié)與作用過程。這些無疑將大大有助于理性高效的

24、開展藥物研發(fā)工作，為藥物研制提供新的思路與途徑。
　　 本研究第二部分將應(yīng)用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)相對定量技術(shù)，并利用TurboSEQUEST軟件與國際蛋白質(zhì)索引(international protein index，IPI)數(shù)據(jù)庫檢索等生物信息學(xué)方法，分離與鑒定正常對照組（CC組），db/db小鼠組（DM組）與db/db小鼠PHL治療組（DMT組）等小鼠視網(wǎng)膜組織的差異表達(dá)蛋白，旨在探討PHL對于db/db小鼠視網(wǎng)膜病變的保護(hù)

25、機(jī)制與作用靶點，為臨床上DM視網(wǎng)膜病變的治療尋找和研發(fā)更有效的藥物而提供蛋白質(zhì)靶標(biāo)，希望有助于理性高效的為治療DM視網(wǎng)膜病變而開展藥物研發(fā)工作。
　　 研究目的:
　　 1.初步探討db/db小鼠視網(wǎng)膜病變的差異表達(dá)蛋白的特征，進(jìn)一步了解DM視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制;
　　 2.探討db/db小鼠經(jīng)PHL治療后視網(wǎng)膜組織的差異表達(dá)蛋白，并篩選以及初步驗證藥物作用的關(guān)鍵蛋白與候選靶標(biāo)，基于蛋白質(zhì)組學(xué)角度進(jìn)一步揭示PHL

26、對于DM視網(wǎng)膜的保護(hù)機(jī)制，從而為開辟DM視網(wǎng)膜病變的治療的新途徑奠定理論基礎(chǔ)。
　　 研究方法:
　　 從正常對照組、db/db小鼠與PHL干預(yù)db/db三組小鼠中各選取4只，分離視網(wǎng)膜組織。按照蛋白質(zhì)組學(xué)樣本制備標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)流程，包括視網(wǎng)膜組織的研磨、切碎、超聲破碎、裂解等流程來提取視網(wǎng)膜總蛋白，并以Bradford蛋白質(zhì)定量法測定蛋白質(zhì)濃度，分裝提取樣品，-80°保存?zhèn)溆?。提取各組視網(wǎng)膜總蛋白后，各組上樣20ug樣品進(jìn)行

27、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，觀察各組之間電泳后蛋白點遷移平行度較好后，再采用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。各組視網(wǎng)膜總蛋白采用FASP酶解得到相應(yīng)各組肽段。各組取60ug肽段，按照ABI公司說明書操作與標(biāo)記消化后的各組肽段，依次分別為114標(biāo)記正常對照組，116標(biāo)記PHL干預(yù)組，117則標(biāo)記db/db組。標(biāo)記結(jié)束后，各組均隨機(jī)選取一定數(shù)量肽段，利用ABI4800 MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀檢測其二級質(zhì)譜圖中低分

28、子量端是否存在相應(yīng)質(zhì)量標(biāo)記試劑，確定標(biāo)記成功后將各組已標(biāo)記的肽段混合，然后用AgilentHPLC1200強(qiáng)陽離子交換柱(strong cation exchange，SCX)進(jìn)行分離分級，收集穿流以及洗脫部分合并成10組，之后予C18 Cartridge脫鹽進(jìn)行下一步質(zhì)譜鑒定。本研究第二部分使用Thermo Finnigan LTQ Velos質(zhì)譜儀進(jìn)行液相質(zhì)譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析(LC-ESI-MS/MS)。質(zhì)譜儀在線配備0.15mm*1

29、50mmC-18反相色譜柱，液相A液為0.1％甲酸水溶液，B液為0.1％甲酸乙腈水溶液（乙腈為84％）。質(zhì)譜的進(jìn)樣方式為Microspray，毛細(xì)管溫度為200度，檢測方式為正離子。多肽和多肽的碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集:每次全掃描(full scan)后采集5個碎片圖譜(MS2 scan)。原始文件(raw file)用iTRAQ Result MultipleFile Distiller分析定量數(shù)據(jù)，并用SEQUEST軟件鑒定

30、多肽分子。最后，使用相關(guān)軟件將定量及鑒定結(jié)果進(jìn)行合并處理，得到定量和鑒定結(jié)果。定量方法采用Identified iTRAQ Statistic Builder軟件分析，采用軟件計算的ratio_biweight值作為蛋白質(zhì)定量結(jié)果，以114標(biāo)記為內(nèi)參。搜索使用的數(shù)據(jù)庫為ipi.MOUSE.v3.72.REVERSED.fasta蛋白庫(SEQUEST結(jié)果過濾參數(shù)為:Protein FDR≤0.01; PeptideFDR≤0.01)。應(yīng)

31、用EXPASY蛋白質(zhì)組學(xué)工具分析等電點、分子量等。并采用基因本體論 GO(http://amigo.geneontology.org/cgi-bin/amigo/go.cgi, Version1.8)對經(jīng)鑒定的視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)功能進(jìn)行分類，從分子功能(Molecular function)、生物過程(Biological process)與細(xì)胞組成(Cellular component)三個方面對蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行定位分類與功能分析。并將篩選

32、出的部分差異蛋白用western blotting方法給予進(jìn)一步驗證其在視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.質(zhì)譜鑒定結(jié)果
　　 經(jīng)LC-ESI-MS/MS鑒定并予軟件分析、數(shù)據(jù)庫檢索，共鑒定出蛋白1651種，符合鑒定條件者可信蛋白1636中，具有唯一肽段8972個。其中鑒定db/db小鼠組與正常對照組視網(wǎng)膜的差異表達(dá)蛋白348個，db/db小鼠視網(wǎng)膜組織表達(dá)上調(diào)的點177個，下調(diào)的點171個。另外，

33、經(jīng)PHL治療后有60個回調(diào)的差異表達(dá)蛋白，其中PHL治療后下調(diào)33個點，上調(diào)27個點。
　　 2.PHL干預(yù)后差異蛋白的定位分析
　　 對于PHL干預(yù)后的60個差異蛋白點，予采用基因本體論GO進(jìn)行定位分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PHL干預(yù)后的差異蛋白包括胞漿蛋白、核蛋白、膜蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白與線粒體蛋白等，其中以胞漿蛋白與核蛋白為主，均占33.87％。其中γ晶體蛋白(γ-crystallin)位于胞漿以及胞核內(nèi)，谷氧還蛋白（gluta

34、redoxin-3）位于胞漿中。
　　 3.PHL干預(yù)后差異蛋白的功能分析
　　 對于PHL干預(yù)后的60個差異蛋白點，根據(jù)已有知識、數(shù)據(jù)庫注釋與文獻(xiàn)資料，采用基因本體論GO進(jìn)行功能分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PHL干預(yù)后的60個差異蛋白點，其功能涉及到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞代謝、凋亡、氧化應(yīng)激等等，其中參與細(xì)胞代謝占55％，比例相對最大。
　　 4.篩選的部分差異蛋白在視網(wǎng)膜組織的表達(dá)改變以驗證
　　 為驗證蛋白質(zhì)

35、組學(xué)鑒定出的差異蛋白在視網(wǎng)膜組織的表達(dá)，應(yīng)用westernblotting方法檢測其中部分差異蛋白如γ晶體蛋白(γ-crystallin)與谷氧還蛋白（glutaredoxin-3）在各組小鼠視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，與正常對照組小鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)比較，γ晶體蛋白在DM小鼠中表達(dá)明顯增高。然而，應(yīng)用PHL治療后，表達(dá)增高的γ晶體蛋白有所下調(diào)。另外，谷氧還蛋白在db/db小鼠中表達(dá)與正常對照組比較明顯降低，經(jīng)過PHL干預(yù)后該蛋白表達(dá)回調(diào)

36、。因此，γ晶體蛋白與谷氧還蛋白的蛋白免疫印跡實驗結(jié)果均與iTRAQ鑒定結(jié)果是一致的。
　　 結(jié)論:
　　 1.作為蛋白質(zhì)組學(xué)的新穎技術(shù)iTRAQ，具有高靈敏性、高通量的特點，能夠?qū)τ诙嘟M樣本同時進(jìn)行比較分析，可以獲得更好的蛋白質(zhì)組覆蓋率。因此，iTRAQ能夠用于研究PHL對db/db小鼠視網(wǎng)膜保護(hù)作用的分子機(jī)制，并助于發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標(biāo)。
　　 2.應(yīng)用LC-ESI-MS/MS鑒定得到PHL干預(yù)db/db小鼠視網(wǎng)膜

37、差異表達(dá)蛋白60個，其中表達(dá)下調(diào)33個，表達(dá)上調(diào)27個，均以胞漿蛋白為主。差異蛋白其功能涉及到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞代謝、凋亡與氧化應(yīng)激等等，提示這些過程與機(jī)制可能參與了DM視網(wǎng)膜的發(fā)生與發(fā)展。
　　 3.在差異表達(dá)蛋白中，以正常對照小鼠視網(wǎng)膜作為對照，蛋白質(zhì)免疫印跡方法發(fā)現(xiàn)，γ晶體蛋白在db/db小鼠組明顯上調(diào)，在PHL干預(yù)組則顯著下調(diào);相反，谷氧還蛋白在db/db小鼠明顯下調(diào)，在PHL干預(yù)組則顯著上調(diào)。該結(jié)果與質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析