倍半萜烯內(nèi)酯類化合物衍生物對db-db小鼠胰島細胞的保護作用.pdf

1、目的:
　　本研究以自發(fā)性2型糖尿病模型-db/db小鼠為實驗研究對象，通過檢測相關指標來了解自主合成的倍半萜烯內(nèi)酯類化合物衍生物對小鼠血糖、血胰島素、血脂、炎癥因子及胰島細胞中NF-κB、iNOS、Bcl-2、Bax等表達的影響，觀察胰島的形態(tài)改變，探討這種新的衍生物對2型糖尿病小鼠胰島β細胞的保護作用及其可能的機制。
　　方法:
　　SPF級15周齡db/m小鼠12只、db/db小鼠24只，雌雄各半，給所有小鼠予基

2、礎飼料適應性飼養(yǎng)1周后，db/mn小鼠設為正常對照組(n=12)，db/db小鼠隨機分為2組:糖尿病模型組(n=12)、倍半萜烯內(nèi)酯類化合物衍生物干預組(ACT001干預組，n=12)。ACT001干預組db/db小鼠每日固定時間給予ACT001混懸液25mg/kg灌胃1次，正常對照組及糖尿病模型組小鼠分別給予相應劑量的生理鹽水灌胃，各組小鼠自由進食飲水，各組小鼠監(jiān)測體重和血糖。小鼠禁食12小時后，從其尾靜脈取血檢測血糖。灌胃給藥12周

3、后實驗結(jié)束，處死小鼠。將小鼠予戊巴比妥鈉麻醉后，留其取血標本用于檢測血清胰島素、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterole，TC);留取小鼠胰腺組織標本用于檢測組織NF-κB、iNOS、Bcl-2、Bax的表達。
　　1.血清學指標的測定
　　小鼠空腹血糖用羅氏ACCU-CHEK血糖儀測定;血清胰島素用酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent a

4、ssay，ELISA)試劑盒測定，小鼠血TG、TC等指標均用全自動生化分析儀測定。
　　2.血脂的測定和IL-1β、TNF-α含量的測定
　　小鼠血清IL-1β、TNF-α用ELISA試劑盒測定。
　　3.小鼠胰腺組織形態(tài)學檢查
　　取小鼠胰腺尾部組織用4％多聚甲醛固定24小時后，經(jīng)梯度酒精脫水，予石蠟包埋，將石蠟切片，切片厚度約為4μm，予HE染色觀察胰島的一般形態(tài)學變化，免疫組化染色檢測小鼠胰島細胞團NF-κ

5、B、iNOS、Bcl-2、Bax表達的變化。
　　4.免疫印跡法(Western blot)檢測各組小鼠胰腺組織中NF-κB、iNOS蛋白表達的變化。
　　5.統(tǒng)計方法
　　本實驗所有計量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)土標準差（X±S）表示，所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)由統(tǒng)計軟件SPSS19.0進行分析完成;各組間均數(shù)采用兩樣本t檢驗進行比較，多組間樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析(One-Way analysis of variance，ANOV

6、A);若方差不齊時，組間均數(shù)比較用Welch檢驗，兩兩比較用Dunnett's T3方法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1.各組小鼠一般情況的變化
　　正常對照組小鼠一般情況良好，精神狀態(tài)佳，活動自如，毛發(fā)亮澤，飲食及大小便無異常，未見死亡;糖尿病模型組、ACT001干預組小鼠一般情況較差，精神狀態(tài)欠佳，行動緩慢，毛發(fā)雜亂無光，有脫發(fā)、皮疹，出現(xiàn)了多飲多尿多食等糖尿病相關癥狀;與糖尿病模型組比較，

7、ACT001干預組小鼠上述情況均有所改善。
　　2.各組小鼠體重的變化
　　干預12周實驗結(jié)束后，與正常對照組小鼠相比較，糖尿病模型組、ACT001干預組小鼠體重明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);糖尿病模型組與ACT001干預組相比體重未見明顯差異。
　　3.各組小鼠血清學指標的變化
　　干預12周實驗結(jié)束后，與正常對照組小鼠相比較，糖尿病模型組、ACT001干預組小鼠空腹血糖、胰島素濃度、TG、TC均

8、明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與糖尿病模型組小鼠比較，ACT001干預組小鼠上述指標有降低(P＜0.05)。
　　4.各組小鼠血清IL-1β、TNF-α表達水平的變化
　　干預12周實驗結(jié)束后，與正常對照組小鼠比較，糖尿病模型組、ACT001干預組小鼠血清IL-1β、TNF-α表達水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與糖尿病模型組小鼠比較，ACT001干預組小鼠血IL-1β、TNF-α表達水平均有

9、降低(P＜0.05)。
　　5.各組小鼠胰腺組織形態(tài)學變化:
　　HE染色顯示:正常對照組小鼠胰腺組織鏡下胰島數(shù)量多，呈團索狀，為圓形或類圓形，胞漿豐富，形態(tài)完整，細胞核居中、胞界清晰;糖尿病模型組小鼠胰島數(shù)量較少，分布零散，形態(tài)不規(guī)則，邊緣不整齊，界限不清晰，細胞體積增大，細胞核呈偏心分布，可見空泡狀變性;與糖尿病模型組小鼠相比較，ACT001干預組小鼠的胰島形態(tài)改變有較明顯的改善。
　　免疫組化染色顯示:與正常對照

10、組小鼠比較，糖尿病模型組、ACT001干預組小鼠胰島細胞中NF-κB、iNOS及促凋亡因子Bax表達明顯增強，抗凋亡因子Bcl-2表達減弱，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與糖尿病模型組小鼠比較，ACT001干預組小鼠胰島細胞中NF-κB、iNOS、Bax表達有減弱，Bcl-2表達增強(P＜0.05)。
　　6.蛋白免疫印跡法檢測各組小鼠NF-κB、iNOS蛋白表達的變化
　　與正常對照組小鼠比較，糖尿病模型組、ACT00

11、1干預組小鼠胰島細胞中NF-κB、iNOS蛋白表達明顯增強，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與糖尿病模型組小鼠比較，ACT001干預組小鼠胰島細胞中NF-κB、iNOS蛋白表達有明顯減弱(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.db/db小鼠與db/m小鼠相比，體重、進食量、飲水量增加，空腹血糖、血脂升高，胰島素濃度增加。
　　2.db/db小鼠與db/m小鼠相比，血清中IL-1β、TNF-α產(chǎn)生和釋放增多。
　

12、　3.db/db小鼠與db/m小鼠相比，胰島細胞中NF-κB、iNOS、Bax表達增強，以及Bcl-2表達減弱，這可促使胰島β細胞功能受損，凋亡增加。
　　4.倍半萜烯內(nèi)酯類化合物衍生物可降低db/db小鼠空腹血糖、血脂、胰島素濃度及減少血清中IL-1β、TNF-α的表達和釋放。
　　5.倍半萜烯內(nèi)酯類化合物衍生物可抑制db/db小鼠胰島細胞中NF-κB的激活，下調(diào)iNOS的表達，改善胰島β細胞功能受損，減少β細胞凋亡的發(fā)生