17β-E2通過GPER-PI3K-AKT通路干預(yù)ATDC5細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)蛋白HSP60活性的研究.pdf

1、背景:據(jù)目前流行病學(xué)研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，骨性關(guān)節(jié)炎以及與軟骨組織相關(guān)的代謝性疾病的發(fā)病率，于絕經(jīng)后的婦女顯著升高，這提示在類固醇激素中的雌激素很可能在對抗骨關(guān)節(jié)退變，以及一些軟骨組織相關(guān)的代謝性疾病的發(fā)生、發(fā)展中可能起到了積極的保護(hù)作用。關(guān)節(jié)軟骨可以對其所覆蓋的軟骨下骨起到保護(hù)作用，同時可以保證關(guān)節(jié)靈活的運動功能，也對震動和沖量的緩沖等都起到及其重要的作用。當(dāng)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生時，關(guān)節(jié)軟骨組織會首先受到影響而發(fā)生功能上的變化，隨著病情的發(fā)展，軟骨組

2、織功能逐漸遭到破壞，若病情得不到緩解而持續(xù)發(fā)展甚至可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞發(fā)生大量壞死吸收，軟骨下骨裸露失去原有軟骨組織的保護(hù)。近年來有研究表明，17β-E2可以與跨細(xì)胞膜受體GPER相結(jié)合，進(jìn)而激活由PI3K/AKT信號途徑所介導(dǎo)的，非基因的高親和力雌激素信號的快速通路。骨關(guān)節(jié)炎形成的核心環(huán)節(jié)是關(guān)節(jié)軟骨組織的退變，軟骨細(xì)胞的減少與代謝功能紊亂直接導(dǎo)致軟骨組織的病變，這與膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生及發(fā)展是密不可分的，近期研究發(fā)現(xiàn)在關(guān)節(jié)退變的軟骨組織有

3、軟骨細(xì)胞凋亡存在。線粒體在細(xì)胞的新陳代謝中起著極其關(guān)鍵的作用，線粒體功能的正常運行是維持人體細(xì)胞基本的生理機能的前提。通常人體細(xì)胞絕大部分生命活動所需的能量，由線粒體通過氧化還原反應(yīng)呼吸鏈提供能量，線粒體可能受到多重的外來及內(nèi)源性損傷因素的損傷，這時線粒體功能受到影響同時嚴(yán)重危及細(xì)胞的功能及生存。細(xì)胞對線粒體的自噬通常情況下是具有選擇性的。細(xì)胞內(nèi)線粒體的數(shù)量以及質(zhì)量通過這種選擇性清除作用得以保證，從而實現(xiàn)了線粒體具有與細(xì)胞代謝相適應(yīng)的數(shù)

4、量與質(zhì)量。在正常組織細(xì)胞中，線粒體自噬是廣泛存在的一種現(xiàn)象，當(dāng)線粒體衰老或功能出現(xiàn)障礙的時候就會產(chǎn)生并且隨時間蓄積大量的活性氧，通過線粒體自噬可以實現(xiàn)及時清除過量蓄積的自由氧。當(dāng)細(xì)胞所處周圍環(huán)境營養(yǎng)共給不足或處于某些惡劣的病理狀態(tài)下時，其可以通過對自身細(xì)胞器進(jìn)行自噬來達(dá)到補充細(xì)胞生命必須物質(zhì)的目的，但在這些病理狀態(tài)中線粒體過度自噬會出現(xiàn)對正常線粒體的自噬作用，這可能影響細(xì)胞功能甚至直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。HSP60蛋白是一類高度保守的ATP依

5、賴的分子伴侶，其作用非常廣泛不僅在蛋白質(zhì)折疊中發(fā)揮作用，還在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及應(yīng)激反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，在線粒體基質(zhì)內(nèi)可檢測到HSP60蛋白質(zhì)。目前，有關(guān)雌激素及其受體GPER參與調(diào)控軟骨細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)蛋白活性的研究尚未見相關(guān)報道，且其機制也尚不清楚。
　　實驗方法:體外培養(yǎng)小鼠ATDC5軟骨細(xì)胞，應(yīng)用實時定量PCR檢測小鼠軟骨細(xì)胞GPER mRNA的表達(dá)情況;Western-blot技術(shù)檢測ATDC5細(xì)胞內(nèi)的GPER蛋白活性表

6、達(dá);分別應(yīng)用濃度梯度17β-E2和/或GPER特異性抑制劑(G15)和/或PI3K特異性拮抗劑(LY294002)干預(yù)細(xì)胞，Western-blot技術(shù)檢測ATDC5細(xì)胞GPER蛋白表達(dá)及AKT總蛋白及磷酸化蛋白水平，檢測ATDC5細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬相關(guān)蛋白（線粒體基質(zhì)蛋白Hsp60）的活性變化。
　　實驗結(jié)果:1、17β-E2增強ATDC5細(xì)胞內(nèi)的GPER mRNA及蛋白活性表達(dá)。實時定量PCR及Western-blot技術(shù)檢測到

7、17β-E2(10-7M，10-8M，10-9M)能夠升高GPER mRNA和磷酸化蛋白水平，且10-7M17β-E2作用明顯，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05); G15可以抑制17β-E2對GPER蛋白活性的調(diào)控作用(P＜0.05)，但GPERmRNA的表達(dá)未受影響;
　　2、17β-E2明顯降低ATDC5細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬相關(guān)蛋白Hsp60活性(P＜0.05);G15可以阻斷17β-E2對Hsp60蛋白活性的抑制作用(P＜0.05