MicroRNA-21通過PTEN-PI3K-AKT信號通路調控C-kit+心臟干細胞增殖和凋亡的機制研究.pdf

1、研究背景及目的：干細胞移植治療成為再生修復梗死心肌的新趨勢。固有心臟干細胞（Cardiac Stem Cells，CSCs），不僅具有組織特異性和低免疫原性等特點，而且可以多向分化為心肌譜系細胞，可顯著減輕心肌梗死后心室重構，改善心功能，故被認為是目前細胞移植治療心肌梗死最為理想的種子細胞源。然而，心肌梗死后，局部微環(huán)境惡劣（氧化應激、炎癥反應，缺血缺氧），致使外源性及內源性干細胞存活量極少，增殖能力受限，不能有效揮再生修復心肌的作用。

2、因此，提高CSCs防御有害刺激的能力，抑制所移植細胞凋亡是提高細胞移植利用率并促使其發(fā)揮生物學功能的重要策略。研究顯示miR-21參與調節(jié)多種腫瘤細胞及心血管譜系細胞的增殖、分化及凋亡等過程。在多數(shù)腫瘤細胞及過氧化氫誘導心肌細胞凋亡模型中，過表達miR-21均可發(fā)揮有效的抗細胞凋亡并促進細胞增殖作用。眾所周知，PI3K/AKT信號通路在細胞增殖、分化和抗凋亡過程中均發(fā)揮重要作用。而miR-21的靶基因之一PTEN可抑制AKT信號通路活化

3、，從而促進細胞凋亡，抑制細胞增殖。因此，本研究擬探討過表達miR-21對常氧狀態(tài)下C-kit+CSCs增殖的影響及相關作用機制，同時通過過氧化氫處理C-kit+CSCs模擬心肌梗死后局部氧化應激的微環(huán)境，探討過表達miR-21對C-kit+CSCs細胞凋亡的調節(jié)作用及其相關作用機制。
　　方法：
　　第一部分
　　1.按照本課題組前期已熟練掌握的酶消化法聯(lián)合磁珠分選法分離、培養(yǎng)并分選SD大鼠C-kit+CSCs，采用免

4、疫熒光檢測C-kti表達情況，采用流式細胞術鑒定細胞純度，并用于后續(xù)試驗。
　　2.以life2000TM為載體將miR-21的陰性對照及模擬物（50nM）轉染至C-kit+CSCs，設立不予任何處理正常細胞為對照組，采用RT-PCR分別檢測轉染后24h、48h、72h，各組C-kit+CSCs中miR-21的表達量，以此確定轉染效率及最佳轉染時間。3.實驗分為3組：①正常對照組（Control組）：不予以任何處理的C-kit+C

5、SCs；②模擬物陰性對照組（mimics nagetive control，MNC組）：轉染miR-21陰性對照的C-kit+CSCs；③模擬物組（Mimics組）：轉染miR-21模擬物的C-kit+CSCs；以RT-PCR分別檢測各組細胞中miR-21 mRNA表達量的變化。
　　4.為驗證體外瞬時轉染miR-21對細胞生物學的影響，分別①采用RT-PCR及免疫熒光檢測各組細胞中心肌細胞早期標記物Nkx2.5、內皮細胞標記物C

6、D31、平滑肌細胞標記物α-SMA mRNA及蛋白的表達情況，以此觀察體外轉染miR-21是否會促進C-kit+CSCs的定向分化。②采用細胞劃痕實驗初步觀察轉染miR-21對C-kit+CSCs遷移的影響。③采用CCK8法檢測轉染后24h、48h、72h三組細胞活力情況，根據(jù)CCK8結果，選擇細胞活力最佳時間點，以Edu法進一步檢測該時間點時各組細胞的增殖狀態(tài)。采用Western blot檢測此時各組細胞中增殖相關蛋白Brdu表達。<

7、br>　　5.上述研究結果表明，過表達 miR-21可在一定程度上促進常氧狀態(tài)下 C-kit+CSCs的細胞增殖。為進一步探討PTEN/PI3K/AKT信號通路是否在過表達miR-21促進C-kit+CSCs增殖這一現(xiàn)象中發(fā)揮重要作用，故將實驗分為五組，①Control組：不予以任何處理的C-kit+CSCs；②MNC組：轉染 miR-21模擬物陰性對照48h的C-kit+CSCs；③Mimics組：轉染miR-21模擬物48h的C-k

8、it+CSCs；④Phen組：加入 PTEN抑制劑 Phen處理1h的C-kit+CSCs，作為 miR-21陽性對照；⑤Mimics+LY294002組：轉染miR-21模擬物48h后予以LY294002處理1小時。同時采用 Edu檢測各組的增殖能力，流式細胞術檢測各組的細胞周期，Western blot檢測各組中增殖相關蛋白Brdu表達，RT-PCR分別檢測各組中PTEN mRNA的表達量變化，Western blot檢測通路相關蛋

9、白PTEN，P-AKT，T-AKT的蛋白表達情況。
　　第二部分
　　6.以不同濃度的H2O2（200、100、50μM）處理C-kit+CSCs2h模擬不同程度的氧化應激微環(huán)境，設立不加H2O2的C-kit+CSCs為對照組，收集細胞后行流式細胞術檢測C-kit+CSCs的存活率、早期凋亡率和壞死率，確定H2O2誘導C-kit+CSCs早期凋亡的最佳合理濃度以模擬氧化應激微環(huán)境。
　　7.為探討過表達miR-21對氧

10、化應激狀態(tài)下C-kit+CSCs細胞凋亡的影響，實驗分為六個組：①對照組(Control)，②模擬物陰性對照組（mimics nagetive control， MNC），③模擬物組（Mimics），④Control+H2O2組，⑤MNC+H2O2組,⑥Mimics+H2O2組。轉染組中予以模擬物及陰性對照轉染48h，在H2O2組中加入H2O2（100μM）處理2h。采用 RT-PCR檢測各組細胞中miR-21 mRNA的相對表達量；采

11、用流式細胞術檢測各組C-kit+CSCs的凋亡率；采用免疫熒光檢測各組中促凋亡蛋白Caspase-3的表達情況；采用Western blot檢測各組中凋亡相關蛋白Caspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白表達情況。
　　8.為進一步探討PTEN/PI3K/AKT信號通路是否在過表達miR-21抑制氧化應激狀態(tài)下C-kit+CSCs細胞凋亡這一現(xiàn)象中發(fā)揮重要作用，將實驗分為5個組：①對照組(Control)，②Control+H2

12、O2組，③Control+H2O2+Phen組，④Mimics+H2O2組，⑤Mimics+H2O2+LY294002組；采用流式細胞術檢測各組細胞凋亡率；采用免疫熒光法檢測各組中促凋亡蛋白Caspase-3的表達情況；采用Western blot檢測各組凋亡相關蛋白Caspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白表達水平；采用RT-PCR檢測各組miR-21 mRNA及PTEN mRNA的表達水平；采用Western blot檢測各組中通

13、路相關蛋白PTEN，P-AKT，T-AKT的蛋白表達情況。
　　結果：
　　第一部分
　　1.體外分離培養(yǎng)的原代CSCs培養(yǎng)48h后可見部分細胞開始貼壁生長，鏡下觀察細胞呈圓形亮點狀、部分細胞貼壁。4-5天后CSCs變?yōu)槎嘟切位蛉切危?-8天時鏡下可見細胞鋪滿整個培養(yǎng)瓶底。磁珠分選后行免疫熒光鑒定結果顯示，表達c-kit的CSCs達90％以上，流式細胞術檢測C-kit+CSCs表面標記，結果顯示：CSCs中表達c-k

14、it的CSCs達90.2%，表達CD45的CSCs僅1.8%，表達CD34的CSCs僅1.0%。
　　2.以life2000TM為載體將miR-21模擬物（50nM）轉染至C-kit+CSCs，以正常未處理細胞為對照，采用RT-PCR檢測轉染24h、48h、72h后各組miR-21表達情況。結果表明，各時間點中，與Control組相比，Mimics組miR-21表達量顯著增高（P<0.05），其中以轉染48h時miR-21表達量最

15、高。轉染48h時，與Control組相比， MNC組miR-21表達量無明顯增加或減少（P>0.05），而Mimics組顯著增高（P<0.05）。因此，以轉染48h為作用條件用于后續(xù)實驗。
　　3. RT-PCR結果表明，三組內 Nkx2.5和 CD31、α-SMA mRNA水平無明顯差異（P>0.05）。免疫熒光實驗結果顯示，與Control組相比，Mimics組和MNC組細胞內心肌細胞譜系標記物Nkx2.5和CD31、α-SM

16、A表達均無顯著差異。細胞劃痕實驗結果發(fā)現(xiàn)，三組之間細胞遷移能力無明顯不同。
　　4. CCK8結果顯示，與Control組相比，轉染miR-21模擬物24、48、72h后C-kit+CSCs細胞活力顯著增加（P<0.05），其中以轉染48h時細胞活力達高峰（P<0.05），而MNC組無顯著差異（P>0.05）。采用Edu檢測各組細胞增殖能力，結果表明，轉染48h時，與Control組相比，Mimics組細胞增殖能力顯著增高（P<0

17、.05），而MNC組無顯著差異（P>0.05）。采用Weston blot檢測各組增殖相關蛋白Brdu表達情況，發(fā)現(xiàn)轉染48h時，與Control組相比，Mimics組Brdu蛋白顯著增高（p<0.05），而MNC組明顯增加或減少（P>0.05），與其Edu熒光結果一致。
　　5.為進一步探討 PTEN/PI3K/AKT信號通路是否在過表達 miR-21促進 C-kit+CSCs細胞增殖這一現(xiàn)象中發(fā)揮重要作用，將實驗分為5個組，E

18、du檢測結果顯示：與Control組比，MNC組細胞增殖能力無明顯改變（P>0.05），Mimics組及Phen組中細胞增殖活力顯著增強（P<0.05）。與 Mimics組比， Mimics+LY294002組中細胞增殖能力受到抑制（P<0.05）。流式細胞術檢測各組細胞周期變化發(fā)現(xiàn)，與 Control相比， MNC組各周期細胞數(shù)無明顯差異（P>0.05），Mimics組及Phen組增殖的心臟干細胞突破 G1/S期限制點進 S期，細胞增

19、殖能力增強（P<0.05）；與Mimics組相比，Mimics+LY294002細胞S期細胞明顯降低（P<0.05）。Western blot檢測各組增殖相關蛋白Brdu的結果與各組Edu及流式細胞術結果一致。RT-PCR檢測結果表明，與Control組相比，PTEN mRNA在Phen組中顯著降低（P<0.05），而在Mimics組、MNC組、Mimics+LY294002中無顯著變化（P>0.05）。Western blot結果表明

20、，與Control組相比，MNC組中PTEN及AKT通路蛋白表達無明顯差異（P>0.05），Mimics組或是Phen組中，PTEN蛋白表達明顯降低，磷酸化AKT蛋白表達顯著增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與Mimics組比， Mimics+LY294002組中PTEN蛋白表達無明顯差異（P>0.05），但磷酸化AKT信號蛋白較Mimics組降低（P<0.05）。各組細胞內總AKT蛋白表達量無明顯差異（P>0.05）。

21、　　第二部分
　　6.流式細胞術結果顯示，與Control、50、200μM H2O2處理組相比，100μM H2O2處理C-kit+CSCs2h可導致C-kit+CSCs早期凋亡率達到最大值（P<0.05），而壞死率無明顯變化（P>0.05）。因此選定100μM H2O2處理C-kit+CSCs2h作為誘導C-kit+CSCs凋亡的最佳合理濃度和時間，以于體外模擬心肌梗死后氧化應激微環(huán)境。
　　7.采用RT-PCR檢測各組

22、中miR-21表達變化，結果顯示，與Control組相比，Mimics組中miR-21表達顯著增加（P<0.05），而MNC組中miR-21表達無差異（P>0.05）。予以100μmol/L H2O2處理C-kit+CSCs2h模擬氧化應激微環(huán)境后，與Control組相比，Control+H2O2組和MNC+H2O2組中miR-21表達量均顯著降低（P<0.05）。與Control+H2O2組相比，Mimics+H2O2組中miR-21

23、表達量明顯升高（P<0.05），但與Mimics組相比，其miR-21表達量降低（P<0.05）。
　　8.采用流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況，結果顯示，與Control組相比，Mimics組和MNC組凋亡率無顯著差異（P>0.05）。予以100μmol/L H2O2處理C-kit+CSCs2h模擬氧化應激微環(huán)境后，與Control相比， Control+H2O2組、MNC+H2O2組中細胞凋亡顯著增加（P<0.05），該兩組間細

24、胞凋亡無明顯差異（P>0.05）。Mimics+H2O2組與Control組相比，凋亡率升高（P<0.05），但與Control+H2O2組相比，其凋亡率明顯降低（P<0.05）。免疫熒光顯示，與Control組比，Mimics組Caspase-3表達無變化，而MNC+H2O2組和Control+H2O2組細胞中Caspase-3表達均明顯增加；與Control+H2O2組相比，Mimics+H2O2組中Caspase-3表達明顯減少。

25、Western blot檢測顯示Control組、 MNC組、Mimics組中凋亡相關蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達量三者之間比較無明顯差異（P>0.05）；予以100μmol/L H2O2處理C-kit+CSCs2h模擬氧化應激微環(huán)境后，與Control組相比， Control+H2O2組和MNC+H2O2組中凋亡蛋白Caspase-3及Bax的表達增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達降低（P<0.05）；與Contr

26、ol+H2O2組相比，Mimics+H2O2組中Caspase-3及Bax的蛋白表達減少，抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表達增加（P<0.05）。
　　9.為進一步探討PTEN/PI3K/AKT信號通路是否在過表達miR-21抑制氧化應激環(huán)境中C-kit+CSCs凋亡這一現(xiàn)象中發(fā)揮重要作用，將實驗分為5個組。流式細胞術結果表明，與Control相比， Control+H2O2組細胞凋亡率增加（P<0.05），而Phen+H2O2組和M

27、imics+H2O2組可明顯減少細胞凋亡（P<0.05）；與Mimics+H2O2組相比， Phen+H2O2組細胞凋亡率升高具有顯著性（P<0.05），Mimics+H2O2+LY294002組細胞凋亡率及壞死率均顯著增高（P<0.05），但仍較Control+H2O2組細胞凋亡率降低（P<0.05）。免疫熒光結果發(fā)現(xiàn)，與Control組比， Control+H2O2組細胞中Caspase-3表達量均明顯增加。與Control+H2O

28、2組相比，Phen+H2O2組及Mimics+H2O2組中Caspase-3表達量明顯減少，與Mimics+H2O2組比，Mimics+H2O2+LY294002組細胞Caspase-3表達顯著增加。同時行Western blot檢測結果顯示，與Control組相比，Control+H2O2組中促凋亡蛋白Caspase-3及Bax的蛋白表達增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表達降低（P<0.05）；而Phen+H2O2組和Mimics+H

29、2O2組中促凋亡蛋白Caspase-3及Bax的蛋白表達減少，抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表達增高（P<0.05）；與Mimics+H2O2組相比，Mimics+H2O2+LY294002組中促凋亡蛋白Caspase-3及Bax的蛋白表達增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表達減少（P<0.05）
　　10. RT-PCR結果顯示：與Control組相比，Control+H2O2組及Phen+H2O2組細胞中miRNA-21表達降低，差

30、異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而后兩組間miR-21表達無明顯差異（P>0.05），Mimics+H2O2組與Mimics+H2O2+LY294002組中miR-21表達顯著增高（P<0.05），該兩組中miR-21表達無明顯差異（P>0.05）；與Control組比，Control+H2O2組中PTEN mRNA表達顯著升高（P<0.05），Control+H2O2+phen組中PTEN mRNA表達明顯下降（P<0.05）。與C

31、ontrol+H2O2組相比， Mimics+H2O2組和Mimics+H2O2+LY294002組中PTEN mRNA表達無明顯差異（P>0.05）。Western blot檢測顯示，與Control組相比，Control+H2O2組中PTEN蛋白表達明顯增加，p-AKT蛋白表達顯著降低（P<0.05）；而Phen+H2O2組和Mimics+H2O2組中PTEN蛋白表達表達減少，p-AKT蛋白表達增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05

32、）；與Mimics+H2O2組相比，Mimics+H2O2+LY294002組中PTEN及p-AKT蛋白表達均顯著減少（P<0.05）?？侫KT蛋白在各組表達無差異（P>0.05）。
　　結論：
　　1.本實驗成功培養(yǎng)分選出高純度且生長狀態(tài)良好的C-kit+CSCs。
　　2.以life2000TM為載體可成功將miR-21轉染至C-kit+CSCs內，且轉染48小時時細胞內miR-21表達量最高。
　　3.過表

33、達miR-21對C-kit+CSCs的分化潛能及細胞遷移作用無明顯影響。
　　4.過表達miR-21可促進常氧狀態(tài)下C-kit+CSCs增殖，而PTEN/PI3K/AKT信號通路可能在這一過程中發(fā)揮重要作用。
　　5.100μMH2O2處理細胞2h可成功建立C-kit+CSCs的體外早期凋亡模型以模擬氧化應激微環(huán)境。
　　6.過表達miR-21可減少氧化應激狀態(tài)中C-kit+CSCs的細胞凋亡，其可能是通過PTEN/P