Trop2基因促進(jìn)小鼠心臟c-kit+細(xì)胞增殖和抗凋亡作用的研究.pdf

1、目的:心臟祖細(xì)胞（CPCs）是一群定居于心臟內(nèi)的具有多向分化潛力的細(xì)胞，它的發(fā)現(xiàn)更新了心臟生物學(xué)，改變了以往所認(rèn)為的心臟是一個(gè)不可再生器官的觀念。然而，CPCs在心肌組織內(nèi)含量極低，并且對(duì)缺血缺氧極為敏感，因此對(duì)梗死心肌組織的修復(fù)能力有限。CPCs具有多種亞型，其中c-kit+細(xì)胞被認(rèn)為在心肌修復(fù)中發(fā)揮主要作用。Trop2是一種多表達(dá)于具有旺盛增殖能力的細(xì)胞膜表面的糖蛋白，活化Trop2具有促進(jìn)多種細(xì)胞增殖和抗凋亡作用的效應(yīng)。本研究的目

2、的是調(diào)查具有快速擴(kuò)增能力的心臟c-kit+細(xì)胞是否也表達(dá)Trop2，如果表達(dá)，Trop2的生物學(xué)效應(yīng)及其相關(guān)機(jī)制。
　　 方法:
　　 一、觀察小鼠心梗以后Trop2+c-kit+細(xì)胞比例變化通過(guò)建立小鼠心梗模型，分別應(yīng)用免疫組織化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)分析心梗急性期內(nèi)Trop2+c-kit+細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化。
　　 二、細(xì)胞分離和培養(yǎng)利用免疫磁珠兩步分離法，從正常小鼠心肌組織中分離出Trop2+c-kit+和Trop2-

3、c-kit+細(xì)胞，并培養(yǎng)于合適的培養(yǎng)基中保持其未分化狀態(tài)；
　　 三、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)構(gòu)建Trop2 shRNA質(zhì)粒，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)將其轉(zhuǎn)染入Trop2+c-kit+細(xì)胞，Western Blot監(jiān)測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)Trop2表達(dá)水平，并在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用BrdU（bromodeoxyuridine）法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。
　　 四、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)為模擬急性梗死心肌組織的炎性微環(huán)境，利用脂多糖刺激小鼠中性粒細(xì)胞，藉此產(chǎn)生條件化培養(yǎng)基，并

4、將含有不同濃度的條件化培養(yǎng)基（CM）分別作用于Trop2+c-kit+細(xì)胞和Trop2-c-kit+細(xì)胞，應(yīng)用Annexin V-APC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　 五、相關(guān)生物學(xué)效應(yīng)機(jī)制探討應(yīng)用Western Blot和免疫復(fù)合物激酶分析技術(shù)，對(duì)可能引起Trop2相關(guān)效應(yīng)的激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和PI3K通路的下游分子進(jìn)行檢測(cè)，探索相關(guān)效應(yīng)的生物學(xué)機(jī)制。
　　 六、體內(nèi)觀察Trop2對(duì)小鼠心臟c-kit+

5、細(xì)胞的保護(hù)作用建立Trop2基因敲除（Trop2-/-）小鼠模型，和野生型小鼠（Trop2+/+）小鼠比較，觀察心肌梗死后c-kit+細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化，同時(shí)對(duì)兩組小鼠進(jìn)行生存分析。
　　 結(jié)果:Trop2在小鼠心肌組織中僅表達(dá)于c-kit+細(xì)胞，在正常生理狀態(tài)下，Trop2+c-kit+細(xì)胞比例極低，但心肌梗死后含量迅速上升，其上升趨勢(shì)和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)。在細(xì)胞水平觀察到，Trop2能促進(jìn)小鼠心臟c-kit+細(xì)胞增殖和在炎性環(huán)

6、境中的抗凋亡能力，這些效應(yīng)的發(fā)生可能與MAPK通路被激活有關(guān)。整體水平亦證實(shí)Trop2能提高梗死心肌組織中c-kit+細(xì)胞的生存能力；同Trop2-/-小鼠相比，Trop2+/+小鼠在心梗急性期具有更高的存活率。
　　 結(jié)論:Trop2通過(guò)增強(qiáng)心臟c-kit+細(xì)胞增殖和抗凋亡能力，在心梗急性期發(fā)揮著重要的保護(hù)作用。利用基因工程的方法使外源性的心臟c-kit+細(xì)胞過(guò)表達(dá)Trop2蛋白，或者使用具有高度選擇性的Trop2受體激動(dòng)劑活