CGRP對(duì)c-kit+心臟干細(xì)胞分化影響的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：目前，急性心肌梗死（AMI）的發(fā)病率逐年上升，且發(fā)病年齡逐漸低齡化，成為不容忽視的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題。臨床上現(xiàn)有治療AMI的方法效果有限，使得人們將目光轉(zhuǎn)向干細(xì)胞療法，干細(xì)胞治療AMI主要通過(guò)兩個(gè)方面：一是通過(guò)其自身分化為目標(biāo)靶細(xì)胞達(dá)到修復(fù)受損心臟的作用；二是通過(guò)分泌各種生物活性因子影響內(nèi)/外源性干細(xì)胞存活并促其發(fā)生分化。c-kitpos心臟干細(xì)胞（c-kit+CSCs）因其特殊的心臟組織特異性及專一性，且具有旁分泌效應(yīng)，是目前備受

2、干細(xì)胞研究者關(guān)注的干細(xì)胞。多項(xiàng)嚙齒類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及前期臨床研究證實(shí)了c-kit+CSCs治療AMI的可行性及有效性，但MI后惡劣的心臟微環(huán)境使移植細(xì)胞存活效率極低，為增強(qiáng)細(xì)胞抵御惡劣環(huán)境的能力以提高細(xì)胞的存活力，人們采用了多種干預(yù)措施，但效果并不理想。如何提高移植后c-kit+CSCs的存活，并促其分化為目標(biāo)靶細(xì)胞是目前亟需解決的問(wèn)題。本課題組經(jīng)過(guò)前期的研究發(fā)現(xiàn)降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）處理c-kit+CSCs后可抑制NF-κB信號(hào)通路，

3、減輕炎癥反應(yīng)、增加移植細(xì)胞存活，但CGRP是否能誘導(dǎo)c-kit+CSCs分化目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。CGRP作為一種具有強(qiáng)大心血管保護(hù)作用的神經(jīng)肽，目前研究其除具有抗炎、抗細(xì)胞凋亡及促進(jìn)生物活性因子釋放等作用外，還可誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等多種細(xì)胞發(fā)生分化。那么，CGRP是否能也能誘導(dǎo)c-kit+CSCs分化呢？為進(jìn)一步研究CGRP對(duì)c-kit+CSCs分化的作用及其可能的機(jī)制，我們?cè)隗w外使用CGRP處理c-kit+CSCs，并觀察其心

4、特異性標(biāo)志物的變化，探討c-kit+CSCs的變化是否與CGRP的誘導(dǎo)有關(guān)，為c-kit+CSCs治療AMI提供新的理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　方法：1.用酶消化法結(jié)合MACS從大鼠心耳中分選出c-kit+CSCs，應(yīng)用FACS鑒定細(xì)胞純度，并用CCK-8法繪制c-kit+CSCs的生長(zhǎng)曲線。
　　2.將剛篩選出的幼稚 c-kit+CSCs作為對(duì)照組，使用 PCR檢測(cè)不同濃度CGRP（0、10-7、10-8、10-9M）作用于

5、c-kit+CSCs后細(xì)胞內(nèi)心臟細(xì)胞的特異性標(biāo)志物的表達(dá)水平，獲得CGRP作用的最佳濃度。
　　3.將未予 CGRP處理的正常 CSCs作為對(duì)照組，免疫熒光觀察 CGRP及CGRP+CGRP8-37作用于c-kit+CSCs后各分化標(biāo)志物的表達(dá)。
　　4.實(shí)驗(yàn)分為四組，分別用地塞米松、CGRP、CGRP+其拮抗劑 CGRP8-37處理細(xì)胞，將CSCs作為對(duì)照，上述分組簡(jiǎn)稱為地塞米松組、CGRP組、CGRP+CGRP8-37組

6、。
　　5.用顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)的變化，并用PCR、Western Blot分別檢測(cè)心臟譜系細(xì)胞的早、晚期特異性標(biāo)志物，以研究CGRP誘導(dǎo)細(xì)胞分化的情況。
　　6.為了進(jìn)一步研究 CGRP誘導(dǎo) c-kit+CSCs分化的可能機(jī)制，用正常c-kit+CSCs作為對(duì)照，采用 ELISA評(píng)估 CGRP及 CGRP+CGRP8-37處理c-kit+CSCs72h后培養(yǎng)基上清液中HGF、VEGF、IGF-1及SDF-1的表達(dá)情況。

7、
　　結(jié)果：1.酶消化法結(jié)合MACS培養(yǎng)及分選出c-kit+CSCs，鏡下觀察細(xì)胞呈梭形或分枝狀，經(jīng)FACS鑒定細(xì)胞表型顯示c-kit87.9％、CD342.3%、 CD452.2%。
　　2.10-8M CGRP處理c-kit+CSCs時(shí)細(xì)胞內(nèi)心肌細(xì)胞分化標(biāo)志物Nkx2.5表達(dá)最高（P＜0.05），以此作為 CGRP的最佳作用濃度，并運(yùn)用此濃度于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中。
　　3. CGRP誘導(dǎo)c-kit+CSCs后，用免疫熒光

8、觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)Nkx2.5、cTnT表達(dá)的紅色熒光及α-SMA及 CD31表達(dá)的綠色熒光均有所增加，在加入 CGRP拮抗劑后熒光的表達(dá)均明顯減少。
　　4.顯微鏡下可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組相比基本沒(méi)有變化， PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與空白組相比較，CGRP誘導(dǎo)可在mRNA水平上提高c-kit+CSCs早期及晚期的心肌細(xì)胞（Nkx2.5、cTnT）、平滑肌細(xì)胞（GATA6、α-SMA）及內(nèi)皮細(xì)胞（Vezf1、CD31）的特異性標(biāo)志物的表達(dá)

9、，且其表達(dá)水平低于地塞米松組（P＜0.05），在加入CGRP拮抗劑CGRP8-37后，這些特異性標(biāo)志物的表達(dá)全部受到抑制（P＜0.05）， Western Blot檢測(cè)到Nkx2.5、cTnT、α-SMA及CD31的表達(dá)趨勢(shì)與PCR相一致（P＜0.05）。
　　5.采用ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)經(jīng)CGRP處理后CSCs分泌的HGF、VEGF、IGF-1及SDF-1與對(duì)照組相比較均有所提高（P＜0.05），在加入CGRP拮抗劑后該現(xiàn)象受到抑