TRAF6調(diào)控c-kit+心臟干細胞分化機制的研究.pdf

1、目的:血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）能夠促進內(nèi)源性心臟干細胞（cardiac stem cells，CSCs）向心肌樣細胞分化。腫瘤壞死因子受體相關因子6（tumor necrosis factor-associated factor6，TRAF6）是一個泛素連接酶，能夠促進P38和JNK介導的非Smad依賴性TGF-β信號通路的激活。然而，其具體的激活機制尚不清楚。本研究擬探討TGF-β/TRAF6是否在c-kit+CSCs分化過程發(fā)揮作用

2、，并對其可能的機制進行初步探索。
　　方法:通過植塊培養(yǎng)和流式分選從新生SD大鼠的心肌組織內(nèi)分離出c-kit陽性的心臟干細胞群，通過細胞表面標記物進行鑒定。TGF-βⅠ受體抑制劑（SB431542）用來抑制SMAD2/3蛋白的磷酸化，靶向性敲除TRAF6的小干擾RNA（siRNA）用以研究TGF-β信號通路中TRAF6的功能，作用于靶標基因3′-UTR區(qū)的TRAF6 siRNA“救援實驗”能夠避免siRNA的脫靶現(xiàn)象。構建TRAF

3、6顯性負性突變體（TRAF6 dominant-negative，TRAF6-DN）并轉(zhuǎn)染傳代c-kit+CSCs。腺病毒介導的轉(zhuǎn)染用來過表達或沉默TRAF6，用TRAF6-siRNA或Ad-TRAF6處理細胞后，檢測心肌特異性蛋白和Wnt信號通路蛋白；免疫共沉淀檢測TRAF6和TGF-β受體的相互作用、TRAF6的泛素化水平；Western免疫印跡法檢測Wnt3a、Wnt5a、Cx-43和cTnT蛋白水平的表達變化。
　　結(jié)果:

4、流式分選出的c-kit+CSCs未檢測到CD34+、CD45+和CD133+的陽性表達。AngⅡ呈時間依賴性的促進c-kit+CSCs內(nèi)P38和JNK的磷酸化，并且這一作用不能被SB431542所抑制。TRAF6-siRNA干擾c-kit+CSCs中AngⅡ介導的P38和JNK磷酸化激活?！熬仍畬嶒灐敝兄亟M的TRAF6 cDNA轉(zhuǎn)導入TRAF6沉默的c-kit+CSCs后，能夠恢復AngⅡ?qū)AK1、JNK和P38的磷酸化激活作用。An

5、gⅡ處理c-kit+CSCs30分鐘后，進行泛素蛋白免疫共沉淀，可以觀察到TRAF6多聚泛素化程度顯著增加。TRAF6沉默增加Wnt3a蛋白表達，而TRAF6過表達降低 Wnt3a蛋白表達，促進AngⅡ介導的心肌特異性蛋白cTnT和Cx-43表達增加。
　　結(jié)論:TRAF6能夠介導AngⅡ激活的非經(jīng)典TGF-β信號通路參與c-kit+CSCs的分化進程，機制可能是通過TRAF6的Lys63多聚泛素化和對下游TAK1、P38和JNK