整合素aVb3在機械通氣性肺損傷中的作用及機制.pdf

1、目的：機械通氣是呼吸衰竭患者不可缺少的生命支持手段，也是手術(shù)患者常用的呼吸管理方法，而機械通氣性肺損傷(ventilator inducedlung injury，VILI)是機械通氣的常見并發(fā)癥，影響機械通氣的治療效果。盡管肺保護通氣策略(小潮氣量機械通氣)能減少VILI的發(fā)生，但為了保證足夠的氣體交換潮氣量的減少常常受到限制，因此尋求VILI有效的藥物預(yù)防仍有重要意義。VILI的主要病理基礎(chǔ)是肺泡炎癥及肺泡毛細(xì)血管通透性增加，但具體

2、機制還不清楚。因此，本研究擬觀察SD大鼠VILI過程中肺泡炎癥反應(yīng)、整合素αVβ3、核轉(zhuǎn)錄因子(nuclearfactor kappa B，NF-κB)的活性，以及人工合成RGDS肽(非特異性整合素受體阻斷劑)對機械通氣導(dǎo)致的aVβ3、NF-κB活性變化的影響，以期闡明整合素αVβ3介導(dǎo)的NF-κB通路在肺泡炎癥中的作用。同時，建立人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human pulmonary microvascular，HPMVEC)的機械牽拉模

3、型，觀察機械牽拉對HPMVEC單層通透性及整合素αVβ3活性的影響，并分析兩者的關(guān)系，以期闡明整合素αVβ3在肺泡毛細(xì)血管通透性中的作用。從而最終明確整合素αVβ3在VILI中的作用及相關(guān)機制，為VILI的防治尋求新的靶點。
　　 方法：動物實驗：21只雄性SD(Sprague Dawley)成年大鼠隨機分為3組(n=7)：對照組(Control組)，大潮氣量機械通氣組(HVT組)；RGDS肽預(yù)處理組(HVT+RGDS組)。各組

4、大鼠麻醉后氣管切開插管，Control組大鼠自主呼吸4 h；HVT組大鼠行機械通氣，潮氣量35 ml/kg，呼吸頻率50次/min；HVT+RGDS組在機械通氣前30 min給予整合素受體阻斷劑RGDS肽5 mg/kg腹腔注射，機械通氣參數(shù)設(shè)定同HVT組。機械通氣4 h后放血處死大鼠，收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavage fluid，BALF)和肺組織。BALF經(jīng)離心分別收集上清和沉淀，用酶聯(lián)免疫吸附實驗(e

5、nzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)檢測上清中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)的濃度，用BAC(bicinchoninic acid)蛋白檢測試劑盒檢測上清中總蛋白的濃度；BALF沉淀用于有核細(xì)胞計數(shù)，并通過細(xì)胞涂片的瑞氏染色對有核細(xì)胞進行分類。左肺組織行蘇木精-伊紅(hematoxyl

6、in-eosin，HE)染色觀察肺組織病理變化；右肺組織提取總蛋白并用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)方法測定整合素αVβ3、NF-κB抑制蛋白(I-κB)的表達以及其磷酸化水平。
　　 細(xì)胞實驗：購買HPMVEC細(xì)胞株進行培養(yǎng)傳代，4～8代細(xì)胞用于實驗。實驗分為3組：對照組(Control組)；機械牽拉組(Stretch組)；ML9預(yù)處理組(Stretch+ML9組)。Control組細(xì)胞靜態(tài)培養(yǎng)在培養(yǎng)箱內(nèi)，不給予機

7、械牽拉；Stretch組細(xì)胞給予機械牽拉刺激2 h；Stretch+ML9組細(xì)胞于機械牽拉前給予肌球蛋白輕鏈激酶抑制劑ML9預(yù)處理(50μM，2 h)。用磁扭力刺激(magnetic twisting stimulation，MTS)對單層內(nèi)皮細(xì)胞實施機械牽拉。用Transwell模型及異硫氰酸熒光素標(biāo)記的右旋糖苷(fluorescrin isothiocyanate marked dextran，F(xiàn)ITC-dextran)溶液檢測單層

8、細(xì)胞通透性，右旋糖苷通過單層內(nèi)皮細(xì)胞的多少代表單層細(xì)胞通透性，用光密度(optical density，OD)表示；用磁扭力細(xì)胞儀(magnetic twisting cytometry，MTC)檢測細(xì)胞間拉力；用免疫熒光染色檢測整合素αVβ3和肌動蛋白的分布；用Western Blot方法檢測整合素αVβ3的表達。
　　 計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行方差分析(ANOVA)，P值小于0.05為差異

9、有顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 動物實驗：(1)Control組大鼠無明顯的病理改變，而HVT組肺組織病理變化明顯，包括炎癥細(xì)胞浸潤、肺泡水腫以及肺泡結(jié)構(gòu)破壞，而HVT+RGDS組的肺組織病理變化較HVT組明顯減輕；(2)與Control組比較，HVT組支氣管肺泡灌洗液中多核細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)量和總蛋白濃度明顯增高；與HVT組比較，HVT+RGDS組支氣管肺泡灌洗液中多核細(xì)胞、單核細(xì)胞及總蛋白明顯減少(P<0.05)；(3

10、)與Control組比較，HVT組支氣管肺泡灌洗液中IL-6，TNF-α濃度明顯增加；與HVT組比較，HVT+RGDS組支氣管肺泡灌洗液中IL-6，TNF-α濃度明顯減少(P<0.05)；(4)與Control組比較，HVT組肺組織整合素αVβ3、I-κB磷酸化明顯增加；與HVT組比較，HVT+RGDS組肺組織整合素αVβ3、I-κB磷酸化明顯減少(P<0.05)。
　　 細(xì)胞實驗：(1)與Control組比較，Stretch組

11、的通透性明顯增加(P<0.05)，而Stretch+ML9組通透性無明顯變化；(2)Control組細(xì)胞肌動蛋白主要分布在細(xì)胞周邊，而Stretch組細(xì)胞漿內(nèi)可見明顯的應(yīng)力纖維形成，Stretch+ML9組肌動蛋白的分布與Control組相似；(3)Control組細(xì)胞整合素αVβ3均勻分布在細(xì)胞表面；而Stretch組細(xì)胞的整合素αVβ3明顯簇積；Stretch+ML9組細(xì)胞整合素αVβ3的分布與Control組相似；(4)與Cont

12、rol組比較，Stretch組細(xì)胞間拉力明顯增加(P<0.05)，而Stretch+ML9組無明顯改變。
　　 結(jié)論：
　　 (1)整合素αVβ3活化參與VILI的炎癥反應(yīng)及毛細(xì)血管通透性增加；
　　 (2)整合素αVβ3介導(dǎo)的NF-κB活化是VILI炎癥反應(yīng)的機制之一；
　　 (3)整合素αVβ3簇積及應(yīng)力纖維形成導(dǎo)致的細(xì)胞間拉力增加是VILI毛細(xì)血管通透性增加的可能機制；
　　 (4)抑制整合