固氮斯氏假單胞菌A1501銨轉運基因amtB的結構分析和功能研究.pdf

1、固氮斯氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501是一株分離自水稻根際的聯(lián)合固氮細菌,屬變形細菌γ亞族.銨轉運基因(ammonium transporter gene)是生物體細胞內外氮素平衡重要基因,而銨又處于整個同化代謝的中央位置,因此詳盡研究該基因對于固氮作用以及調節(jié)機制研究有重要意義.通過對其全基因組序列分析、設計兩對引物,經PCR從野生型A1501中擴增出2684bp的片段,經過序列比對和Blast序列比較

2、后確定包含amt完整基因,并且確定該菌含有兩個緊密連鎖的銨載體基因為amtB1和amtB2,分別包含12和11個跨膜結構域.并且在兩個基因之間無啟動子和終止子序列,利用RT-PCR方法證實了這一結果. 本研究從野生型A1501提取細菌總DNA,并分別克隆amtB1、amtB2部分片段,連接到自殺質粒載體pK18mob或pT18mob上,通過三親接合與野生菌A1501進行同源單交換,經過抗性篩選獲得了amtB1極性突變株、非極性突

3、變株以及amtB2非極性突變株,分別命名為TB12極性突變株,TB1突變株,TB2突變株. 在高銨條件下測定細胞生長曲線發(fā)現(xiàn),所有突變株相對于野生菌生長表型沒有什么差異,但是在低銨濃度下,TB12極性突變株相對于野生菌A1501在平板顯示出生長緩慢,而兩個非極性突變TB1、TB2與野生菌A1501相似.測定銨吸收實驗中發(fā)現(xiàn),突變株TB1、TB2和野生菌胞外銨濃度下降趨勢相似,而TB12極性突變株胞外銨濃度基本保持不變,證明兩個銨

4、載體基因突變的確影響細胞的轉運能力.接下來生理實驗測定結果顯示:在菌株生長到穩(wěn)定期后,TB12具有一定泌銨能力.當amt任何基因的突變后,并未影響到固氮酶活性,但是在固氮條件下,銨激后極性突變株的表型特征與其它菌株不一致,仍能保持比較高的固氮酶活性,而非極性突變和野生菌基本喪失固氮酶活性. 將極性突變株.TB12和野生型A1501接種水稻,研究水稻光合作用和固氮作用之間的互作.結果表明:施用固氮菌后,對水稻有明顯的促生作用,但突