固氮施氏假單胞菌RpoN和RpoS對鞭毛合成和趨化調控機制的研究.pdf

1、在自然界中,為了適應復雜多變的外界環(huán)境,原核生物需要通過誘導不同σ因子來調控特定基因的轉錄與表達。σ因子在微生物的進化過程中產生了種類和功能上的差異。根據結構和功能可將其可分為兩類:σN因子和σ70家族因子。目前研究較為深入的σ因子為σ70、σ54和σ38。對σ因子的研究大多數都是在轉錄組水平上,隨著研究的深入發(fā)現轉錄因子的調節(jié)是一個十分復雜的過程,是諸多因素作用的結果。在原核生物中,其通常以多重調控網絡的方式來調節(jié)某一外界的刺激應答,

2、許多證據顯示轉錄的激活取決于大量的轉錄因子的相互作用。在大腸桿菌中發(fā)現多個σ因子協(xié)同或拮抗調控趨化、鞭毛合成等某些特殊基因的表達。假單胞菌中是否存在和大腸桿菌相類似的調控機制,目前仍不清楚。本研究以施氏假單胞菌A1501為研究對象,構建了rpoN缺失突變株ΔrpoN及其功能互補菌株Comp-rpoN。并利用實驗室已有的rpoS缺失突變株ΔrpoS,就RpoN和RpoS對菌株鞭毛合成與趨化的調控進行了相關研究。并取得了以下主要結果:

3、>　　1.利用三親本結合的方法構建了rpoN基因缺失突變株和功能回補株。
　　2.LB培養(yǎng)基中,ΔrpoN生長非常緩慢,穩(wěn)定期的菌體密度只有野生型的50％;Comp-rpoN的生長恢復到野生型的80%——即rpoN基因突變影響了菌株在正常條件下的生長。而rpoS基因的缺失對菌株生長并沒有顯著的影響。分別以2MNacl沖擊、20mMH2O2沖擊處理,ΔrpoS對鹽沖擊和H2O2沖擊比較敏感,ΔrpoS存活率明顯下降;而以50℃熱沖擊

4、后,ΔrpoS的存活率與野生型沒有明顯差異。
　　3.在固氮條件下,rpoN基因的缺失使得菌體喪失了固氮能力,Comp-rpoN的固氮酶活性僅恢復到野生型的30%;ΔrpoS的固氮酶活性下降到野生型的75%。
　　4.趨化實驗表明ΔrpoN趨化能力喪失,ΔrpoN喪失了趨化能力,而ΔrpoS趨化能力卻增強了。通過透射電鏡觀察發(fā)現,rpoN突變株為鞭毛合成缺陷體;rpoS突變后菌體鞭毛與野生型相比更細、更長。
　　5.通

5、過phyre2分析發(fā)現,RpoN蛋白具有7個α螺旋結構和2個β折疊結構。RpoN具有三個功能結構域,C末端具有保守的RpoN-BoX保守序列:421-IAGLLEAQGIQVARRTVAKYRESLGIAPSSERKRLL-457。RpoS蛋白具有14個α螺旋結構及1個β折疊結構。該蛋白C端DNA-binding氨基酸序列:286-EASTLEEVGQEIGLTRERVRQIQVEALRRLREILERNGLSSDALFQ-332。通過

6、Weblogo預測A1501中依賴RpoN啟動子保守結合序列為TGGCACNNNNNTTGC,依賴RpoS啟動子保守結合序列為CTANNNTG。
　　6.利用pTwin1載體構建了pT-rpoN融合表達載體,在大腸桿菌BL21(DE3)中導入pT-rpoN表達了RpoN蛋白,并以幾丁質柱對其進行純化。選擇鞭毛等級調控系統(tǒng)中的關鍵調控基因fliA,擴增其上游300bp的序列為探針,通過凝膠阻滯實驗發(fā)現其與RpoS結合。而沒有發(fā)現Rp