假單胞菌M18應(yīng)答調(diào)控基因ppbR的克隆及功能研究.pdf

1、革蘭氏陰性細(xì)菌存在著與菌群傳感（Quorum Sensing）相關(guān)聯(lián)的雙元調(diào)控系統(tǒng)（two-component regulatory system），雙元系統(tǒng)參與調(diào)控細(xì)菌多種生命活動(dòng)。根據(jù)銅綠假單胞菌基因組序列分析表明，銅綠假單胞菌中有64個(gè)應(yīng)答調(diào)控子基因和63個(gè)組氨酸激酶基因，然而許多雙元調(diào)控系統(tǒng)的生物功能仍然未知，目前只有少數(shù)例如GacA-GacS、PprA-PprB等雙元系統(tǒng)有相關(guān)生物功能的文獻(xiàn)報(bào)道，在假單胞菌中，GacA-Gac

2、S、PprA-PprB這兩個(gè)調(diào)控系統(tǒng)參與調(diào)控菌群傳感關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)和信號(hào)分子合成等細(xì)菌的生命活動(dòng)。 PA2572基因位于銅綠假單胞菌PAO1全基因組上，是根據(jù)其保守氨基酸基序、結(jié)構(gòu)特征或者與其它已知功能的基因具有一定同源性而推測(cè)出其功能的基因，屬于Ⅲ類基因(class3)，根據(jù)推測(cè)，PA2572編碼蛋白可能是一個(gè)雙元調(diào)控系統(tǒng)的應(yīng)答調(diào)節(jié)子，通過(guò)蛋白比對(duì)結(jié)果表明PA2572編碼蛋白是一個(gè)含有 REC(CheY-like)結(jié)構(gòu)域和H

3、D-GYP 結(jié)構(gòu)域的應(yīng)答調(diào)節(jié)子，并推測(cè)與細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)力、次生代謝產(chǎn)物合成、蛋白質(zhì)分泌以及與菌群傳感(Quorum Sensing)系統(tǒng)相關(guān)聯(lián)。但是所有這些功能只是通過(guò)同源性分析推測(cè)，并沒(méi)有得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及相關(guān)報(bào)道。 假單胞菌M18( Pseudomonas sp. M18) 是從甜瓜根際土壤中分離到的促進(jìn)植物生長(zhǎng)的根際細(xì)菌，迄今為止的文獻(xiàn)報(bào)道中唯一能同時(shí)分泌藤黃綠菌素(Pyoluteorin, Plt)和吩嗪-1-羧酸(Phena

4、zine-1-carboxylic acid，PCA) 兩種抗生素的假單胞菌株，通過(guò)菌種鑒定，假單胞菌M18和銅綠假單胞菌PAO1的相似性比較高。為了進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究PA2572基因的同源基因在假單胞菌M18中的功能，本研究從M18基因組DNA中克隆出PA2572基因的同源基因ppbR，序列分析表明M18的ppbR基因序列與銅綠假單胞菌PAO1的PA2572基因序列同源程度為99.63％。構(gòu)建了基因ppbR突變株M18P，通過(guò)對(duì)野生株

5、和突變株在泳動(dòng)能力、群集運(yùn)動(dòng)能力、PCA和Plt生物合成的動(dòng)力學(xué)分析、菌群傳感系統(tǒng)信號(hào)分子產(chǎn)量變化等相關(guān)研究，初步確認(rèn)了ppbR基因在假單胞菌M18中的功能作用。研究結(jié)果表明，突變株M18P在在泳動(dòng)能力和群集運(yùn)動(dòng)能力上有顯著的下降。在KMB和PPM培養(yǎng)基中，突變株合成PCA的能力比野生型有顯著的下降。特別是在PPM發(fā)酵液中PCA積累量?jī)H為野生型的50％。在KMB培養(yǎng)基中，突變株P(guān)lt的積累量和野生型沒(méi)有顯著的差異。在PPM和KMB培養(yǎng)基