熒光假單胞菌GcM5-1A溶血素的基因克隆及其活性研究.pdf

1、本文利用基因克隆技術(shù)探究了松材線蟲攜帶的熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens) GcM5-1A是否含有溶血素基因以及溶血素活性。根據(jù)熒光假單胞菌疑似溶血素的基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增得到疑似溶血素基因Hly。將該基因克隆到表達(dá)載體pET-15b上，構(gòu)建了pET-15b-Hly。重組質(zhì)粒pET-15b-Hly轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)構(gòu)建工程菌株，工程菌經(jīng)過(guò)異丙基-β-D硫代半乳糖苷（IP

2、TG）誘導(dǎo)后，SDS-PAGE分析表明，工程菌全蛋白比未轉(zhuǎn)化重組表達(dá)載體的E. coli BL21(DE3)多出一條帶，條帶約在26 kDa大小左右，這與序列分析時(shí)所預(yù)測(cè)的熒光假單胞菌溶血素大小相吻合，疑似溶血素在大腸桿菌中得到了表達(dá)。
　　利用Ni-Sepharose6（FF）親和樹脂純化了重組蛋白，溶血實(shí)驗(yàn)顯示，純化的重組蛋白可使雞紅細(xì)胞發(fā)生溶血，證實(shí)本研究所克隆基因確實(shí)編碼溶血素。溶血素大致可分三類：酶類、成孔類、表面活性劑

3、類，為探究熒光假單胞菌重組溶血素溶血機(jī)制，本文進(jìn)行了滲透保護(hù)實(shí)驗(yàn)、金屬離子及酶抑制劑對(duì)溶血素溶血效應(yīng)影響實(shí)驗(yàn)及100℃高溫處理實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，金屬離子及酶抑制劑沒(méi)能促進(jìn)或抑制熒光假單胞菌重組溶血素的溶血活性，高溫處理后溶血素失去溶血活性，聚乙二醇能夠抑制溶血素活性，這說(shuō)明，重組溶血素為成孔類毒素。
　　重組溶血素對(duì)黑松切根苗毒性實(shí)驗(yàn)顯示，無(wú)菌水處理切根幼苗長(zhǎng)勢(shì)良好，無(wú)萎蔫現(xiàn)象，溶血素處理的黑松幼苗死亡率隨溶血素濃度增大而也逐漸

4、升高。處理4d后，20μg/mL溶血素就表現(xiàn)出對(duì)黑松幼苗的毒性，當(dāng)溶血素濃度為100μg/mL時(shí)，黑松幼苗的死亡率達(dá)到100%。4℃條件下用濃度為60μg/mL溶血素處理黑松愈傷組織細(xì)胞4 d，愈傷組織存活率比未用溶血素處理的愈傷組織細(xì)胞存活率下降了21.41％,27℃條件下濃度60μg/mL溶血素處理黑松愈傷組織細(xì)胞24h內(nèi)可致黑松愈傷組織細(xì)胞死亡。
　　本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，松材線蟲攜帶熒光假單胞菌GcM5-1A可合成溶血素，重組