家蠶新的免疫基因Spatzle克隆與功能及假單胞菌致病性研究.pdf

1、家蠶是一種典型的鱗翅目昆蟲,栽桑養(yǎng)蠶在我國有著5000年以上的悠久歷史,蠶桑生產是我國的傳統(tǒng)優(yōu)勢產業(yè),然而蠶病給養(yǎng)蠶業(yè)造成很大的損失。由于產業(yè)發(fā)展的需要,家蠶的免疫防御機制是人們長期關注的熱點。開展家蠶免疫相關基因的功能研究,一方面將為闡明家蠶對病原微生物的免疫應答和昆蟲免疫系統(tǒng)的進化的分子機制奠定基礎,也將為培育高抗病能力的家蠶品種提供理論依據。另一方面,由于半數以上的糧食作物和森林害蟲屬于鱗翅目,家蠶作為第一個全基因組測序的鱗翅目昆

2、蟲,其免疫基因功能的研究對鱗翅目昆蟲特異免疫相關基因的分離克隆和功能闡釋,對害蟲防治新途徑和新型環(huán)保型農藥的開發(fā)等都具有重要意義。
　　本論文通過利用生物信息學、分子生物學等多種方法,克隆并鑒定了家蠶免疫相關基因spatzle4(spz4),并對其進行組織及誘導表達分析。具體研究結果如下:
　　1.家蠶spatzle4基因的克隆
　　以家蠶5齡第3天幼蟲表皮組織提取RNA,以RNA為模板,反轉錄合成cDNA第1鏈,然后

3、利用已知序列設計引物進行PCR,克隆測序?，F(xiàn)已克隆出家蠶spatzle4蛋白基因的完整開放閱讀框。我們還利用3’-RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技術得到目的基因的3’非翻譯區(qū)。
　　2.家蠶spatzle4基因的結構及其分子進化分析
　　家蠶spatzle4的結構與序列分析表明該基因位于第3號染色體上,在基因組中只有1個拷貝。該基因有4個外顯子,3個內含子,編碼425個氨基酸殘基

4、,分子質量為49.36 kD,等電點為5.31。N端預測沒有信號肽。BmSPZ蛋白疏水性最大值為1.733,最小值為-3.011,蛋白質基酸序列的疏水和親水區(qū)域交錯排列。SPZ樣蛋白沒有跨膜結構。BmSPZ氨基酸序列與蜜蜂、埃及伊蚊、赤擬谷盜、致倦庫蚊、岡比亞按蚊、麗蠅蛹集金小蜂、果蠅和豌豆蚜的SPZ親緣關系較近,而與哺乳動物的SPZ親緣關系相對較遠。
　　3.家蠶spatzle4基因的組織表達及微生物誘導表達分析
　　用5

5、齡第3天家蠶幼蟲各組織RNA進行RT-PCR的半定量分析,研究結果表明,該基因在家蠶5齡第3天幼蟲不同組織中有不同水平的表達,其中以頭部中的表達量相對最高,其次在表皮,精巢中有少量表達,其余組織中沒有檢測到此基因的表達。
　　向五齡三天的家蠶幼蟲體表,分別注射無菌ddH2O、經福爾馬林處理過的大腸桿菌,芽孢桿菌,酵母菌。微生物注射24小時后,取家蠶幼蟲表皮組織,提取總RNA,進行半定量分析。結果表明大腸桿菌的注入不能使家蠶spat

6、zle4的表達量發(fā)生變化,而芽孢桿菌及酵母菌的注射使家蠶spatzle4的表達量升高。說明革蘭氏陽性菌及真菌能誘導家蠶spatzle4的表達量提高。研究表明,果蠅對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌及真菌具有不同的免疫誘導途徑。我們的實驗結果與果蠅的不同種類微生物的誘導結果一致。
　　4.熒光假單胞菌Pf-1基因的克隆及其該菌對家蠶的感染性研究
　　在從家蠶功能基因的克隆過程中我們擴增出一序列片段,克隆測序后將所得序列在NCBI中做