家蠶新的免疫基因Spatzle克隆與功能及假單胞菌致病性研究.pdf

1、家蠶是一種典型的鱗翅目昆蟲,栽桑養(yǎng)蠶在我國(guó)有著5000年以上的悠久歷史,蠶桑生產(chǎn)是我國(guó)的傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè),然而蠶病給養(yǎng)蠶業(yè)造成很大的損失。由于產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需要,家蠶的免疫防御機(jī)制是人們長(zhǎng)期關(guān)注的熱點(diǎn)。開展家蠶免疫相關(guān)基因的功能研究,一方面將為闡明家蠶對(duì)病原微生物的免疫應(yīng)答和昆蟲免疫系統(tǒng)的進(jìn)化的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ),也將為培育高抗病能力的家蠶品種提供理論依據(jù)。另一方面,由于半數(shù)以上的糧食作物和森林害蟲屬于鱗翅目,家蠶作為第一個(gè)全基因組測(cè)序的鱗翅目昆

2、蟲,其免疫基因功能的研究對(duì)鱗翅目昆蟲特異免疫相關(guān)基因的分離克隆和功能闡釋,對(duì)害蟲防治新途徑和新型環(huán)保型農(nóng)藥的開發(fā)等都具有重要意義。
　　本論文通過(guò)利用生物信息學(xué)、分子生物學(xué)等多種方法,克隆并鑒定了家蠶免疫相關(guān)基因spatzle4(spz4),并對(duì)其進(jìn)行組織及誘導(dǎo)表達(dá)分析。具體研究結(jié)果如下:
　　1.家蠶spatzle4基因的克隆
　　以家蠶5齡第3天幼蟲表皮組織提取RNA,以RNA為模板,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈,然后

3、利用已知序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR,克隆測(cè)序?，F(xiàn)已克隆出家蠶spatzle4蛋白基因的完整開放閱讀框。我們還利用3’-RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技術(shù)得到目的基因的3’非翻譯區(qū)。
　　2.家蠶spatzle4基因的結(jié)構(gòu)及其分子進(jìn)化分析
　　家蠶spatzle4的結(jié)構(gòu)與序列分析表明該基因位于第3號(hào)染色體上,在基因組中只有1個(gè)拷貝。該基因有4個(gè)外顯子,3個(gè)內(nèi)含子,編碼425個(gè)氨基酸殘基

4、,分子質(zhì)量為49.36 kD,等電點(diǎn)為5.31。N端預(yù)測(cè)沒有信號(hào)肽。BmSPZ蛋白疏水性最大值為1.733,最小值為-3.011,蛋白質(zhì)基酸序列的疏水和親水區(qū)域交錯(cuò)排列。SPZ樣蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)。BmSPZ氨基酸序列與蜜蜂、埃及伊蚊、赤擬谷盜、致倦庫(kù)蚊、岡比亞按蚊、麗蠅蛹集金小蜂、果蠅和豌豆蚜的SPZ親緣關(guān)系較近,而與哺乳動(dòng)物的SPZ親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。
　　3.家蠶spatzle4基因的組織表達(dá)及微生物誘導(dǎo)表達(dá)分析
　　用5

5、齡第3天家蠶幼蟲各組織RNA進(jìn)行RT-PCR的半定量分析,研究結(jié)果表明,該基因在家蠶5齡第3天幼蟲不同組織中有不同水平的表達(dá),其中以頭部中的表達(dá)量相對(duì)最高,其次在表皮,精巢中有少量表達(dá),其余組織中沒有檢測(cè)到此基因的表達(dá)。
　　向五齡三天的家蠶幼蟲體表,分別注射無(wú)菌ddH2O、經(jīng)福爾馬林處理過(guò)的大腸桿菌,芽孢桿菌,酵母菌。微生物注射24小時(shí)后,取家蠶幼蟲表皮組織,提取總RNA,進(jìn)行半定量分析。結(jié)果表明大腸桿菌的注入不能使家蠶spat

6、zle4的表達(dá)量發(fā)生變化,而芽孢桿菌及酵母菌的注射使家蠶spatzle4的表達(dá)量升高。說(shuō)明革蘭氏陽(yáng)性菌及真菌能誘導(dǎo)家蠶spatzle4的表達(dá)量提高。研究表明,果蠅對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌及真菌具有不同的免疫誘導(dǎo)途徑。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與果蠅的不同種類微生物的誘導(dǎo)結(jié)果一致。
　　4.熒光假單胞菌Pf-1基因的克隆及其該菌對(duì)家蠶的感染性研究
　　在從家蠶功能基因的克隆過(guò)程中我們擴(kuò)增出一序列片段,克隆測(cè)序后將所得序列在NCBI中做