巴西固氮螺菌glnba基因的功能分析

1、中國農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文巴西固氮螺菌glnB李季倫2002.6.1±里壅些查堂堡主堂堡堡苧 一一A B S T R A C TT h ef u n c t i o no f g l n Bg e n ec l o n e df r o mag e n o m i cl i b r a r yo f A z o s p i r i l l u mb r a s i l e n s eY u 6 2w a sa n a l y z

2、 e d ．T h eg e n ew a sm u t e d ／nv i t r ob y i n s e r t i n gt h eK m - c a s s e t t ei n t ot h e 毋川lr e s t r i c t i o ns i t e o fg l n B 。t h e n t h em u t a t i o nw a s t r a n s f o r m e di n t ow i l dt y

3、 p e 一．b r a s i l e n s eY u 6 2 t ok n o c k o u t t h eg e n o m i c西n Bg e n e ，t h u so b t a i n e d t h eg I 啦m u t a n t s t r a i n ( g l n B ：：K m ) ．T h ee n c o d i n gr e g i o n o f g l n B w a s c l o n e

4、di n t o v e c t o rp V K t o oa n dw a s , I r a u s f e r r e di n t oA ．b r a s i l e m eY u 6 2 ，g l n B “ m u t a n ta n dd r a Tm u t a n ts t r a i n sr e s p e c t i v e l y ．I ts h o w e d t h a tt h eg l n B “

5、m u t a n tl a c k e dn i t r o g e n a s e a c t i v i t y , i ．e ．i t sp h e n o t y p ew a sn i t ' , w h i l et h ec o m p l e m e n t s t r a i nw a s a sn o r m a l ∞w i l d t y p eY U 6 2 ．T h eg r o w t hs p

6、e e do f t h e m u t a n t sa n dw i l d t y p eY u 6 2w a s t h es 帥e ．I nw i l dt y p eY u 6 2 a n dd r a T m u t a n t s c o n t a i n i n g m u l t i p l ec o p i e so fg l n Bg e n e ，t h en i t r o g e n a s e a c

7、t i v i t yw a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e r t h a nt h o s es t r a i n sw i t h o u t m u l t i p l ec o p i e so f g l n B g e n e ．i no r d e r t oc o n s t r u c ts t r a i n st h a tc a ne x c r e t ea m m

8、 o n i u m i n t oe n v i r o n m e n t ，w e c o n d u c t e d i nv i t r om u t a g e n e s i so f g l n Ag e n ef r o m 一．b r a s i l e n s eY u 6 2 ，b yi n s e r t i n gt ＆- e l e m e n t ( r e s u l t i n gr e s i s

9、t a n c eo fa n t i b i o t i c ss p e c t i n o m y c i n ) i n t o t h eu n i q u e s i t eo f N r u l ．T h em u t a t i o nw a s t r a n s f o r m e d i n t ow i l dt y p eA ．b r a s i l e n s e Y u 6 2 t o k n o c k

10、o u t t h e g e n o m i c g f ，叫g e n e ，a n d g o t g l n d 。m u t a n t s t r a i n ( g l n A ：：n ) ．T h eg r o w t h a b i l i t i e sa t t h ep r e s e n c eo f a m m o n i a a n dg l u t a m a t ea n d t h en i t r

11、o g e n u s e a c t i v i t yo f t h em u t a n t sw e r e a n a l y z e d ．T h e r e s u l t s d e m o n s t r a t e dt h a t t h e m u t a n t c o u l d u t i l i z e n e i t h e ra m m o n i u mn o rg l u t a m a t e

12、∞s o l e n i t r o g e ns o u r c Ⅺ．A st om e G S a c t i v i t yo f t h e m u t a n t s ，i ts h o w e d t h a t l l l eG S a c t i v i t yo ft h em u t a n t sw a so n l y ∞h i g h a sa b o u taq u a r t e ro ft h ew i

13、l dt y p e ．N i t r o g e n a s ea c t i v i t i e so ft h em u t a n t sw e r e t w o t i m e sh i g h e r t h a n t h e w i l d t y p e ．A l s ow e d e t e r m i n e d t h ea m m o n i a e x c r e t i o na b i l i t yo

14、 ft h e m u t a n ts t r a i n s ．i t o c c u r r e d t h a t t h eg l n A ’m u t a n t c o u l de x c r e t e m o r ea m m o n i ai n t o t h ee n v i r o n m e n t t h a n w i l d t y p e 一．b r a s i l e n s e Y u 6 2

15、。a n d n i t r a t ec a n s t i m u l a t e t h ea m m o n i a e x c r e t e db y t h em u t a n t s T h e t r i a l s t oo b t a i n t h ef u l ls e q u e n c e o f g l n A g e n e w e ∞f a i l e d ．K e y W o r d s A z