X射線對(duì)子宮內(nèi)膜及卵巢生殖功能影響的分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　X射線在人類生活中無處不在，既有來自于外太空的自然本底輻射，同時(shí)，在醫(yī)療領(lǐng)域中，X射線被廣泛應(yīng)用于疾病的診斷及治療。X射線能夠穿透包括人體組織在內(nèi)的多種物質(zhì)，造成組織發(fā)生病理性損傷，造成這種損傷的主要機(jī)制是由于電離輻射通過在細(xì)胞中產(chǎn)生大量自由基而造成的。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，電離輻射在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用愈加廣泛，輻射帶來的危害越來越受到人們的關(guān)注，特別是X射線對(duì)生殖系統(tǒng)的影響。因此，探索X射線影響女性生殖能力的機(jī)制及尋找更為

2、有效的輻射保護(hù)劑顯得尤為重要。
　　胚胎著床是一個(gè)極為復(fù)雜的生物學(xué)過程，不但需要子宮內(nèi)膜具有良好的接受態(tài)，也需要卵巢具有正常的排卵功能及規(guī)律的激素分泌，其中，任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)功能失調(diào)都會(huì)導(dǎo)致不孕癥的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢中過量的ROS(ReactiveOxygen Species)聚集會(huì)導(dǎo)致卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡，影響正常排卵及激素分泌。當(dāng)子宮組織自身抗氧化能力下降時(shí)，其生長(zhǎng)會(huì)受到抑制。已有報(bào)道表明:線粒體與溶酶體在細(xì)胞衰老的過程中發(fā)

3、揮重要作用。目前，關(guān)于X射線通過氧化性損傷影響女性生殖系統(tǒng)功能是否與線粒體及溶酶體功能損傷相關(guān)尚未見報(bào)道。
　　自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞中的生理現(xiàn)象，正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的自噬水平較低，當(dāng)受到外界刺激時(shí)，自噬水平會(huì)增加，利用溶酶體的吞噬作用降解細(xì)胞內(nèi)的毒物，利于細(xì)胞的存活。然而，當(dāng)自噬水平過高時(shí)，會(huì)造成細(xì)胞的死亡。研究表明，ROS在細(xì)胞的自噬過程具有調(diào)控作用。然而，自噬在X射線影響子宮內(nèi)膜接受態(tài)的過程中發(fā)揮何種作用及相關(guān)信號(hào)通路尚需

4、要進(jìn)一步研究。
　　N-乙酰半胱氨酸(N-acetycysteine，NAC)，是一種含有活性巰基(-SH)的分子，可抑制或減少不同原因造成的組織氧化性損傷。NAC作為細(xì)胞內(nèi)還原性谷胱甘肽的前體分子，是一種常用的抗氧化劑。已有一些研究表明，NAC作為一種粘痰溶解藥物在臨床上被廣泛應(yīng)用已有四十多年的歷史。然而NAC是否能應(yīng)用于電離輻射暴露引起的女性生殖系統(tǒng)損傷的保護(hù)仍未見報(bào)道。
　　本文通過體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)，分別探討X射線對(duì)人子

5、宮內(nèi)膜細(xì)胞的氧化性損傷機(jī)制，X射線引起人子宮內(nèi)膜細(xì)胞中發(fā)生自噬的途徑，自噬在子宮內(nèi)膜接受態(tài)損傷過程中發(fā)揮的作用，及NAC對(duì)X射線誘導(dǎo)小鼠卵巢發(fā)生功能衰竭過程中的保護(hù)作用和機(jī)制。本文的研究有助于探討電離輻射影響女性生殖健康的分子機(jī)制，并為NAC在電離輻射造成女性不孕癥的治療中提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　?。ㄒ唬射線通過影響溶酶體及線粒體功能導(dǎo)致人子宮內(nèi)膜細(xì)胞內(nèi)DNA氧化性損傷影響其功能
　　1.RL95-2細(xì)胞進(jìn)

6、行2 Gy的X線照射及NAC，NH4C1和抑胃肽A(PepstatinA，PepA)預(yù)處理;
　　2.CCK-8檢測(cè)人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(RL95-2)存活率;
　　3.利用透射電鏡及掃描電鏡觀察RL95-2細(xì)胞內(nèi)外部形態(tài)變化;
　　4.利用體外胚胎粘附模型檢測(cè)RL95-2細(xì)胞對(duì)人滋養(yǎng)層細(xì)胞(JAR)的接受性;
　　5.利用羅丹明123熒光染色法進(jìn)行RL95-2細(xì)胞線粒體膜電位的檢測(cè);利用Westernblot檢測(cè)

7、細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C（Cytochrome C，Cyt C）從線粒體中釋放的情況;
　　6.利用Lyso-tracker red熒光染色法進(jìn)行RL95-2細(xì)胞溶酶體膜穩(wěn)定性的檢測(cè);利用Western blot檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)中組織蛋白酶D(CathepsinD，CD)從溶酶體中釋放的情況;
　　7.利用DCFH-DA熒光染色法進(jìn)行RL95-2細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)ROS生成的檢測(cè);利用免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞中8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)形成;

8、r>　　8.利用彗星實(shí)驗(yàn)，免疫熒光及激光共聚焦和Western blot分別檢測(cè)RL95-2細(xì)胞DNA斷裂和磷酸化組蛋白(γH2AX)的表達(dá)水平。
　?。ǘ射線通過生成ROS引起人子宮內(nèi)膜上皮RL95-2和HEC細(xì)胞自噬的途徑和意義
　　1.細(xì)胞進(jìn)行2 Gy和10 GyX射線照射及NAC，3-MA預(yù)處理;
　　2.Western blot檢測(cè)凋亡及增殖相關(guān)蛋白的表達(dá);利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況;
　　3

9、.掃描電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬小體的形成;Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá);Lyso tracker red及MDC熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬水平;
　　4.DCFH-DA熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的形成;
　　5.Western blot檢測(cè)MAPKs信號(hào)通路的激活;
　　6.抑制自噬后利用體外胚胎粘附模型檢測(cè)RL95-2細(xì)胞對(duì)人滋養(yǎng)層細(xì)胞(JAR)的接受性;利用集落形成實(shí)驗(yàn)繪制細(xì)胞存活曲線。
　?。ㄈ?/p>

10、NAC對(duì)X射線導(dǎo)致小鼠卵巢功能衰竭中的保護(hù)作用
　　1.小鼠進(jìn)行NAC預(yù)處理及3 GyX射線全身照射;
　　2.ELISA分析照射后小鼠血清中雌激素，孕激素，抗穆氏管荷爾蒙及促卵泡生成素的表達(dá)水平;
　　3.小鼠卵巢稱重檢測(cè)卵巢重量變化;
　　4.HE染色觀察卵巢中各級(jí)卵泡形態(tài)的變化;
　　5.Western blot及免疫組化檢測(cè)卵巢組織中PCNA的表達(dá)水平;
　　6.免疫組化檢測(cè)卵巢組織中Cyt

11、C和caspase-3的表達(dá)水平;TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)卵巢組織中凋亡的水平;
　　7.利用總谷胱甘肽檢測(cè)試劑盒檢測(cè)卵巢組織中GSH水平;利用免疫組化檢測(cè)8-OHdG的表達(dá);
　　8.掃描電鏡觀察子宮內(nèi)膜吞飲泡的形成;H&E染色觀察子宮內(nèi)膜上皮形態(tài)學(xué)變化;雄雌鼠交配后，統(tǒng)計(jì)交配率，受精率及胚胎粘附率。
　　結(jié)果:
　?。ㄒ唬射線通過影響溶酶體及線粒體功能導(dǎo)致人子宮內(nèi)膜細(xì)胞內(nèi)DNA氧化性損傷影響其功能
　　1.

12、X射線降低RL95-2細(xì)胞存活率，細(xì)胞呈衰老趨勢(shì)，細(xì)胞表面微絨毛增加;RL95-2細(xì)胞與JAR細(xì)胞間的粘附率下降;
　　2.X射線降低線粒體膜電位及溶酶體膜穩(wěn)定性;
　　3.X射線誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激及DNA的氧化性損傷;
　　4.X射線誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)DNA發(fā)生雙鏈斷裂;
　　5.細(xì)胞經(jīng)過NAC，NH4C1及PepA預(yù)處理后，能夠不同程度的保護(hù)溶酶體與線粒體功能，降低氧化應(yīng)激水平及DNA損傷，并且促進(jìn)JAR與RL9

13、5-2細(xì)胞的粘附。
　?。ǘ射線通過生成ROS引起人子宮內(nèi)膜上皮RL95-2和HEC細(xì)胞自噬的途徑和意義
　　1.X射線促進(jìn)細(xì)胞凋亡;
　　2.X射線造成細(xì)胞內(nèi)發(fā)生自噬;
　　3.NAC預(yù)處理后經(jīng)X射線照射，細(xì)胞內(nèi)的自噬水平顯著降低;
　　4.X射線通過激活JNK信號(hào)通路引起自噬，NAC預(yù)處理抑制JNK信號(hào)通路;
　　5.抑制自噬會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)的凋亡水平，減少RL95-2和HEC細(xì)胞與JAR細(xì)胞間的

14、粘附，增加細(xì)胞對(duì)射線的敏感性。
　?。ㄈ㎞AC對(duì)X射線導(dǎo)致小鼠卵巢功能衰竭中的保護(hù)作用
　　1.X射線導(dǎo)致小鼠卵巢重量減輕;
　　2.X射線減少小鼠血清中雌激素，孕激素及抗穆氏管荷爾蒙的表達(dá)，增加促卵泡生成素的表達(dá);
　　3.X射線顯著減少卵巢中原始卵泡，初級(jí)卵泡的形成，對(duì)腔前卵泡影響不顯著，會(huì)增加閉鎖卵泡的形成;
　　4.X射線影響子宮內(nèi)膜形態(tài)，產(chǎn)生不規(guī)則形態(tài);顯著抑制子宮內(nèi)膜上皮中吞飲泡的形成;顯著影

15、響雌鼠生育能力;
　　5.X射線抑制卵巢顆粒細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡;
　　6.X射線誘導(dǎo)卵巢細(xì)胞中發(fā)生氧化應(yīng)激;
　　7.NAC預(yù)處理顯著恢復(fù)卵巢的卵泡形成，激素分泌，減少氧化應(yīng)激水平，抑制凋亡，促進(jìn)增殖，改善子宮內(nèi)膜形態(tài)與功能，在一定程度上恢復(fù)胚胎粘附。
　　結(jié)論:
　?。ㄒ唬射線通過影響溶酶體及線粒體功能導(dǎo)致人子宮內(nèi)膜細(xì)胞內(nèi)DNA氧化性損傷影響其功能
　　1.X射線造成溶酶體及線粒體功能下降;

16、>　　2.溶酶體線粒體功能的下降導(dǎo)致氧化性DNA損傷;
　　3.線粒體-溶酶體軸在氧化損傷中發(fā)揮作用;
　　4.抗氧化劑NAC及溶酶體保護(hù)劑NH4C1和PepA對(duì)X射線造成的RL95-2細(xì)胞損傷均有保護(hù)意義并且改善細(xì)胞功能。
　　（二）X射線通過生成ROS引起人子宮內(nèi)膜上皮RL95-2和HEC細(xì)胞自噬的途徑和意義
　　1.X射線通過增加細(xì)胞內(nèi)ROS引起自噬;
　　2.ROS通過激活JNK信號(hào)通路引起自噬;<