細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng)電子傳遞及底物作用機(jī)制的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究.pdf

1、細(xì)胞色素P450是一類(lèi)在自然界廣泛分布的血紅素分子依賴(lài)的酶蛋白家族，其主要功能是參與機(jī)體內(nèi)源分子的生物合成及異源分子的代謝。該家族成員在催化反應(yīng)過(guò)程中所具有的高度特異性使其在環(huán)保、化工和藥物代謝等領(lǐng)域都具有極大的應(yīng)用價(jià)值，因而成為了生物催化研究的熱點(diǎn)。
　　 雖然細(xì)胞色素P450的相關(guān)研究已歷經(jīng)半個(gè)世紀(jì)，但對(duì)其中三個(gè)方面的認(rèn)識(shí)還極為有限：電子傳遞蛋白之間的特異性識(shí)別機(jī)制；底物如何進(jìn)入活性中心；突變體影響酶活性的基礎(chǔ)。本論文主要通

2、過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段對(duì)這三個(gè)方面進(jìn)行了系統(tǒng)的研究和分析。
　　 論文第一部分工作解析了一條來(lái)源于Novosphingobium aromaticivoransDSM12444中的Ⅰ類(lèi)型細(xì)胞色素P450電子傳遞系統(tǒng)的三個(gè)成員（鐵氧還蛋白還原酶ArR、鐵氧還蛋白Arx和細(xì)胞色素P450氧化酶CYP101DI）的三維晶體結(jié)構(gòu)。雖然這些蛋白在整體結(jié)構(gòu)上與已報(bào)道的同家族蛋白較為相似，但也具有自身獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，尤其在鐵氧還蛋白還原酶、鐵氧還蛋

3、白和P450蛋白相互識(shí)別的表面具有極明顯的差別。通過(guò)與另兩條完整的Ⅰ類(lèi)型電子傳遞系統(tǒng)(PdR/Pdx/CYP101A1和AdR/Adx/CYP24A1)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)Arx蛋白主要是通過(guò)正負(fù)電荷相互作用識(shí)別ArR和CYP101D1，同時(shí)揭示了異源電子傳遞蛋白低效支持P450酶活性的基礎(chǔ)。
　　 論文第二部分解析了細(xì)胞色素P450蛋白CYP101D2一種特殊的開(kāi)放構(gòu)象，并通過(guò)底物樟腦分子浸泡得到的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)揭示了三處潛在的樟腦分子

4、作用位點(diǎn)：活性中心處的樟腦分子以其羰基氧原子與提供血紅素鐵第六配位鍵的水分子作用形成一種罕見(jiàn)的中間態(tài)結(jié)合方式；第二處和第三處樟腦分子的結(jié)合能力較弱，分別定位于開(kāi)放通道內(nèi)和酶蛋白分子表面的一個(gè)凹槽內(nèi)，我們認(rèn)為這兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)很可能是底物識(shí)別及轉(zhuǎn)入到活性中心前的中間狀態(tài)。由此我們推測(cè)了一條合理的底物進(jìn)入活性中心的通道，并進(jìn)一步支持了底物的多步結(jié)合機(jī)制。
　　 論文的最后一部分工作解析了細(xì)胞色素P450蛋白CYP102A1(P450BM

5、3)單加氧酶結(jié)構(gòu)域兩個(gè)單點(diǎn)突變體A330P和1401P的晶體結(jié)構(gòu)，闡明了二者在底物催化活性上區(qū)別于野生型蛋白的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在突變體A330P的結(jié)構(gòu)中，由于突變?cè)斐?29位脯氨酸被強(qiáng)行擠入原底物結(jié)合通道從而有效限制了活性中心的大小，使得該突變體增強(qiáng)了對(duì)非天然小分子底物的催化能力。I401P突變體則在結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出了許多該野生型蛋白在底物結(jié)合狀態(tài)下所具有的特征：提供血紅素鐵原子第六配位鍵水分子的異常；近血紅素一側(cè)的loop遠(yuǎn)離活性口袋；I螺旋處