STBM介導(dǎo)樹突狀細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)與PE發(fā)病的研究.pdf

1、目的:
　　子癇前期(PE)是一種復(fù)雜疾病，其病因及發(fā)病機(jī)制均不明，以孕20周后母體出現(xiàn)高血壓、蛋白尿等為主要特征，PE是一種影響全身小動(dòng)脈的特發(fā)性疾病，能夠引起產(chǎn)婦和胎兒腦出血、昏迷和早產(chǎn)。而合體滋養(yǎng)細(xì)胞微泡(STBM)是母體釋放的胎盤源性不良因子之一。人胎盤的合體滋養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生和分泌大小不同、形態(tài)和功能各異的胞外囊泡狀結(jié)構(gòu)，并且參與妊娠期母胎之間的對(duì)話。STBM是合體滋養(yǎng)細(xì)胞激活或凋亡時(shí)由合體滋養(yǎng)細(xì)胞胞膜脫落下來(lái)的較大的囊泡(0

2、.2-2um)。STBM脫落的同時(shí)，合體滋養(yǎng)細(xì)胞會(huì)分泌外泌體(exosome)，只是體積更小，直徑為納米級(jí)的(30-150nm)。STBM被釋放入血后被胎盤絨毛覆蓋，并且有對(duì)應(yīng)的生物學(xué)功能。STBM在母體免疫系統(tǒng)中的主要作用是促炎性免疫激活，而外泌體則能夠通過(guò)多種途徑降低母體免疫。有研究發(fā)現(xiàn)PE患者外周血中的STBM的濃度較正常的孕婦或未孕婦女高，且早發(fā)型重度子癇前期尤甚。
　　免疫-炎癥反應(yīng)實(shí)際上在孕早期就存在于正常妊娠母體內(nèi)，

3、但程度輕微且受嚴(yán)密調(diào)控，近年研究表明，PE發(fā)病的中心環(huán)節(jié)之一就是母胎免疫耐受失衡。妊娠是一種成功的半同種移植現(xiàn)象，既往研究表明正常妊娠時(shí)母體免疫狀態(tài)以Th2-Treg型免疫耐受為主，即維持母體的免疫耐受狀態(tài)從而保護(hù)胎兒免受母體免疫系統(tǒng)攻擊，妊娠得以繼續(xù);而PE時(shí)母體免疫狀態(tài)則以Th1-Th17型免疫激活為主，使全身系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)急劇擴(kuò)大，最終引發(fā)多器官功能病變。
　　樹突狀細(xì)胞(Dendreitic cells，DCs)是體內(nèi)功能

4、最為強(qiáng)大的專職抗原遞呈細(xì)胞，在誘導(dǎo)免疫耐受中發(fā)揮重要作用，但樹突狀細(xì)胞在妊娠免疫調(diào)節(jié)中扮演什么角色目前尚未完全闡明。有研究表明DCs具有誘導(dǎo)免疫耐受和免疫激活的雙面性，而其成熟狀態(tài)決定免疫應(yīng)答的結(jié)局。成熟的DCs表達(dá)與抗原遞呈相關(guān)的組織相容性復(fù)合物(MCHⅡ)類分子、表面共刺激分子CD80、CD86等，可以誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而使機(jī)體向Th1-Th17型免疫方向轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)母體系統(tǒng)性炎癥反應(yīng);而未成熟DC（immature DC

5、s，iDCs），將抗原遞呈給CD4+T細(xì)胞后不能將其激活，誘導(dǎo)機(jī)體向Th2-Treg方向轉(zhuǎn)移，介導(dǎo)胎兒抗原特異性免疫耐受狀態(tài)。有研究表明STBM具有激活粒細(xì)胞、誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，調(diào)節(jié)促炎性細(xì)胞因子釋放的功能。同時(shí)STBM也可誘導(dǎo)單核細(xì)胞，引起TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等細(xì)胞因子釋放增強(qiáng)，從而調(diào)節(jié)Th1-Th17/Th2-Treg免疫失衡。而DCs與粒細(xì)胞和單核細(xì)胞具有相同的前體細(xì)胞，鑒于STBM與DCs的密切關(guān)系，我們?cè)噲D通過(guò)

6、觀察胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞微泡對(duì)樹突狀細(xì)胞分化狀態(tài)的影響，初步探討STBM對(duì)樹突狀細(xì)胞表型分化、合成分泌及抗原提呈等生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步明確了STBM、DCs與子癇前期發(fā)生系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)的關(guān)系。為重建PE患者免疫監(jiān)視以維持母體免疫狀態(tài)提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為干預(yù)、阻斷孕晚期免疫失衡所致的全身系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)這一病理過(guò)程奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　第一部分:子癇前期患者胎盤組織中樹突狀細(xì)胞的分子表達(dá)及分布特點(diǎn)
　　1.嚴(yán)格

7、按照納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)選取第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院（大坪醫(yī)院）產(chǎn)科2014年01月-2015年9月間收治的子癇前期患者（PE組）17例和正常晚孕患者（control組）20例，均取擇期剖宮產(chǎn)術(shù)后的胎盤組織。
　　2.HE染色觀察正常妊娠胎盤組織與子癇前期患者胎盤組織的絨毛和血管的差異;
　　3.免疫組化方法檢測(cè)正常妊娠胎盤組織與子癇前期患者胎盤組織DCs的分布狀態(tài)、部位以及數(shù)量差異性;
　　結(jié)果:
　　1.HE染

8、色可見PE患者胎盤組織中血管腔較正常晚孕對(duì)照組的小，且血管閉塞，絨毛血液明顯灌注不足。
　　2.免疫組化結(jié)果可見子癇前期患者胎盤組織中CD1a+DCs的數(shù)量較正常晚孕期組少(P＜0.05)。
　　3.免疫組化結(jié)果可見子癇前期患者胎盤組織中CD83+DCs的數(shù)量較正常晚孕期組多（P＜0.05）。多(P＜0.05)。
　　第二部分:小鼠合體滋養(yǎng)細(xì)胞微泡(STBM)對(duì)樹突狀細(xì)胞(DCs)分化及免疫功能的影響
　　方法:

9、
　　1.機(jī)械法和差速離心法制備小鼠合體滋養(yǎng)細(xì)胞微泡(STBM):8周齡C57BL/6小鼠，于妊娠第18天戊巴比妥麻醉后，無(wú)菌條件下剪開小鼠串珠樣子宮取出胎盤，放入消毒后的冰磷酸鹽緩沖液(PBS)中反復(fù)沖洗，直至PBS中無(wú)殘留血液和蛻膜，無(wú)菌紗布吸干水分后稱重，無(wú)菌眼科剪將胎盤剪碎（約1mm3），按2.5g/100mL的比例加入NaCl溶液（1％青-鏈霉素），4℃振蕩過(guò)夜，次日取上清離心:1500g，10min，取上清;10000

10、g，60min，取上清;100000g，60min，取沉淀;4℃的PBS（含5％蔗糖）重懸。
　　2.制備小鼠樹突狀細(xì)胞(DCs):無(wú)菌條件下取6周齡雌性C57BL/6小鼠的股骨、脛骨，用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后，應(yīng)用重組鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Recombinant mouse gramulocyre-macrophage，rmGM-CSF）和重組鼠白介素4（Recombinant mouse Interleukin-4

11、，rmIL-4）進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)DCs，DCs分組如下:A組:陰性對(duì)照組:DCs+PBS;B組:DCs+STBM(1.0μg/mL);C組:DCs+STBM(1.5μg/mL);D組:DCs+STBM(2.0μg/mL);E組:DCs+STBM(2.5μg/mL);F組:DCs+LPS(2.0μg/mL)。
　　3.透射電子顯微鏡觀察鑒定STBM。將STBM稀釋40倍，滴液法制片，待樣品干燥后上機(jī)觀察。
　　4.免疫熒光方法

12、鑒定檢測(cè)小鼠樹突狀細(xì)胞。
　　5.通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)(Flow CytoMetry，F(xiàn)CM)檢測(cè)各組DCs表達(dá)CD11c和CD86的變化。
　　6.應(yīng)用蛋白印跡法(Western Blot)檢測(cè)各組DCs表達(dá)CD80和CD86的變化。
　　7.應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA法）檢測(cè)DCs分泌TNF-α、IFN-γ、IL-12的水平。
　　結(jié)

13、果:
　　小鼠合體滋養(yǎng)細(xì)胞微泡(STBM)對(duì)樹突狀細(xì)胞表型及免疫功能的影響
　　1.STBM的形態(tài)學(xué)觀察:掃描電子顯微鏡下可見STBM為雙層膜囊泡狀結(jié)構(gòu)，Image-Pro Plus6.0軟件測(cè)得STBM囊泡狀的直徑為0.647μm-1.438μm，平均值為(1.025±0.236)μm。
　　2.免疫熒光可見培養(yǎng)至第5天簇集成團(tuán)落狀的樹突狀細(xì)胞。
　　3.STBM刺激DCs后其表型分化:以不同濃度的STBM(1

14、.0μg/mL、1.5μg/mL、2.0μg/mL、2.5μg/mL)作用于GM-CSF誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓DCs，流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)不同處理組細(xì)胞表面分子CD11c的表達(dá)水平無(wú)明顯差異性（P＞0.05）;而各組細(xì)胞CD86表達(dá)水平隨STBM濃度的升高而增加。濃度分別為1.0μg/mL、1.5μg/mL、2.0μg/mL、2.5μg/mL的STBM，其CD11c/CD86雙陽(yáng)性表達(dá)率分別為46.1±3.5％，56.9±2.8％，60.5±3

15、.2％，88.9±3.0％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.Western Blot法檢測(cè)不同濃度STBM刺激DCs后，DCs表達(dá)CD80、CD86蛋白量隨著STBM濃度的增高而逐漸增多，CD80、CD86是小鼠成熟DCs的特異性分子，其蛋白量表達(dá)越多，表明成熟DCs的數(shù)量越多。由圖可看出，STBM1.5μg/mL、STBM2.0μg/mL、STBM2.5μg/mL組與PBS（control組）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

16、P＜0.05）。
　　5.分泌TNF-α的水平:不同濃度的STBM(STBM1.0μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、6.0μg/mL)刺激DCs，其誘導(dǎo)DCs產(chǎn)生的TNF-α的濃度分別為(6.91±1.37)pg/mL、(7.98±1.55)pg/mL、(9.40±0.93)pg/mL、(12.65±1.62)pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　分泌IFN-γ的水平:不同濃度的STBM(STBM

17、2.0μg/mL、4.0μg/mL)刺激DCs，其誘導(dǎo)DCs產(chǎn)生的IFN-γ的濃度分別為(12.14±1.39)pg/mL、(17.52±1.67)pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　分泌IL-12的水平:不同濃度的STBM(STBM2.0μg/mL、4.0μg/mL、6.0μg/mL)刺激DCs，其誘導(dǎo)DCs產(chǎn)生IL-12的濃度分別為(6.98±1.19)ng/L、(7.88±0.10)ng/L、(9.18±1.