14-3-3epsilon在小鼠卵母細(xì)胞G2期阻滯中作用的研究.pdf

1、小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育成熟過程中要經(jīng)歷兩個(gè)停滯期，分別為GV期（生發(fā)泡期）和MⅡ期（第二次減數(shù)分裂中期），GV期即處于第一次減數(shù)分裂的G2期末，該時(shí)期典型的形態(tài)學(xué)特征是有一個(gè)被稱為(germinal vesicle，GV)的大細(xì)胞核，簡稱GV期。每個(gè)生殖周期，在孕激素的作用下，部分卵母細(xì)胞恢復(fù)第一次減數(shù)分裂，標(biāo)志是生發(fā)泡破裂(GVBD)，伴隨著核質(zhì)的成熟，卵母細(xì)胞發(fā)育到MⅡ期，成為可受精的卵。如何超越GV期阻滯，啟動(dòng)卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂，發(fā)生

2、G2/M轉(zhuǎn)變對卵母細(xì)胞發(fā)育成熟至關(guān)重要。但是小鼠卵母細(xì)胞G2期阻滯中的機(jī)制目前尚未完全研究清楚。14-3-3蛋白是一種高度保守的，大小約28-31 KDa的酸性蛋白家族。哺乳動(dòng)物至少有七種基因編碼14-3-3蛋白亞型，而酵母、果蠅和線蟲只有兩種基因編碼，植物有13種基因編碼14-3-3蛋白。哺乳動(dòng)物14-3-3蛋白種類豐富，是目前研究最多的蛋白質(zhì)，共包括七個(gè)亞型，分別為β，γ，ε，σ，ζ，τ和η，并且各亞型都有特殊的功能。它們通常形成同

3、二聚體或異二聚體發(fā)揮作用，功能涉及到細(xì)胞周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生長、腫瘤生長、應(yīng)激反應(yīng)、疾病發(fā)生等諸多生理、病理過程。14-3-3蛋白通常作為一種“調(diào)質(zhì)蛋白”或“伴侶蛋白”在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)間來回穿梭，以調(diào)節(jié)與之結(jié)合的靶蛋白的功能。
　　 Cdc25蛋白家族是一種雙特異性磷酸酶，包括Cdc25A，B，C三種磷酸酶，分別在有絲分裂中發(fā)揮重要作用。Cdc25A主要在G1/S期轉(zhuǎn)變時(shí)發(fā)揮作用，Cdc25B可激活cyclinB

4、-cdc2復(fù)合體，導(dǎo)致G2/M期轉(zhuǎn)變，Cdc25C只有在有絲分裂期才有活性，被cyclinB-cdc2高度磷酸化后，形成正反饋環(huán)。利用基因敲除技術(shù)沉默小鼠Cdc25B基因，由于卵母細(xì)胞發(fā)生減數(shù)分裂阻滯而導(dǎo)致母鼠不孕;而顯微注射Cdc25B mRNA卻可以恢復(fù)減數(shù)分裂。這些實(shí)驗(yàn)充分說明了Cdc25B對于小鼠卵母細(xì)胞的發(fā)育是必須的。研究證明Cdc25B蛋白的活性和亞細(xì)胞定位由14-3-3蛋白調(diào)節(jié)。Uchida S等人的研究也證實(shí)14-3-3

5、β，ε與人的Cdc25B的309位被磷酸化的絲氨酸結(jié)合，驅(qū)動(dòng)Cdc25B定位于細(xì)胞質(zhì)。在G2期阻滯的爪蟾卵母細(xì)胞中，14-3-3蛋白與Cdc25蛋白結(jié)合在一起，調(diào)控卵母細(xì)胞的成熟。爪蟾卵母細(xì)胞中的研究表明，PKA可直接磷酸化Cdc25的287位絲氨酸，此位點(diǎn)磷酸化后導(dǎo)致14-3-3蛋白的結(jié)合，Cdc25活性受抑，卵母細(xì)胞發(fā)生G2期阻滯。哺乳動(dòng)物卵在許多方面與爪蟾相似。了解低等動(dòng)物卵成熟的調(diào)節(jié)機(jī)制，對研究和認(rèn)識哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟具有重要

6、的借鑒意義。與爪蟾卵母細(xì)胞Cdc25-S287的情況相近，在人類細(xì)胞系中G2期阻滯也涉及14-3-3蛋白的結(jié)合。14-3-3蛋白作為重要的接頭蛋白，從酵母到人類，在真核生物G2期阻滯中發(fā)揮穩(wěn)定的保守性作用。那么，小鼠卵母細(xì)胞是否存在14-3-3蛋白，它與Cdc25B蛋白在卵母細(xì)胞發(fā)育中的作用尚不清楚。為了驗(yàn)證14-3-3蛋白在小鼠卵母細(xì)胞G2期阻滯中的作用，本研究以小鼠卵母細(xì)胞為研究對象，觀察14-3-3蛋白和Cdc25B蛋白的表達(dá)和亞

7、細(xì)胞定位情況，構(gòu)建14-3-3表達(dá)載體，通過過表達(dá)和沉默14-3-3蛋白，觀察對小鼠卵母細(xì)胞在G2/M轉(zhuǎn)變的影響。構(gòu)建14-3-3熒光表達(dá)載體，利用熒光蛋白為標(biāo)簽觀察14-3-3與Cdc25B在卵母細(xì)胞中的共定位，探討14-3-3蛋白調(diào)控卵母細(xì)胞G2/M轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制，為哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞發(fā)育的機(jī)理研究提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 一、材料與試劑中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供昆明系雌性白小鼠;pBSK-Cdc2

8、5B由TonyHunter教授(The Salk Institute)惠贈(zèng);pEGFP-C3由復(fù)旦大學(xué)劉喻博士惠贈(zèng);克隆載體pGEM-T vector為Promega公司產(chǎn)品;表達(dá)載體pcDNA3.1為Invitrogen公司產(chǎn)品; pmax-FP-Red-C為Promega公司產(chǎn)品，E.coli DH5α感受態(tài)菌株為購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（Piece Biotechnology公司）;預(yù)染蛋白Marker

9、、限制性內(nèi)切酶XhoI、BamHI、XbaI、EcoRI及Pfu DNA Polymerase（MBI公司）;MB培養(yǎng)液、LB培養(yǎng)基（Invitrogen公司）;DNA Marker、Taq酶(Takara公司);mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra kit體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion公司);快速微量mRNA提取純化試劑盒(GE Healthcare公司);protein G-agarosebeads懸液（GE Heal

10、thcare公司）;質(zhì)粒DNA小提取試劑盒（Qiagen公司）;去內(nèi)毒素質(zhì)粒中量提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒（Omega公司）;Cdc2-pTyr15磷酸化抗體、Cdc25B一抗(E-19)、β-Actin抗體(Santa Cruz); Western細(xì)胞裂解液、Hoechst33258（碧云天生物技術(shù)公司）;HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG、FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、TRITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG（北京中

11、杉金橋生物技術(shù)有限公司）;二丁酰環(huán)磷酸腺苷(dbcAMP)、M2和M16培養(yǎng)液（Sigma公司）。
　　 二、小鼠卵母細(xì)胞的采集和培養(yǎng)3-4周齡的昆明種雌性白小鼠，腹腔注射10 IU孕馬血清(PMSG)，48h后頸椎脫臼法處死，剖開腹腔取出卵巢，放于含有125μmol/LdbcAMP的M2培養(yǎng)液中，在體視顯徽鏡下刺破大的有腔卵泡，獲得含完整生發(fā)泡的裸卵母細(xì)胞，在MB培養(yǎng)液(在Waymouth MB752/Ⅰ培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上添加10

12、0μg/ml丙酮酸鈉，50U/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素，3mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，此培養(yǎng)液簡稱為MB培養(yǎng)液）中，在37℃、5％CO2、飽和濕度的CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
　　 三、重組載體的構(gòu)建取小鼠肝組織30mg，用Trizol提取總RNA。設(shè)計(jì)特異性引物，用RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化，將回收純化的HA-14-3-3ε克隆到pGEM-T載體上，測序后挑選鑒定正確的陽性克隆與pcDNA3.1-ZEO(

13、+)載體/pmax-FP-Red-C載體同時(shí)用EcoRI酶切后連接，構(gòu)建成pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε和pmax-FP-Red-HA-14-3-3ε融合表達(dá)載體，重組載體經(jīng)測序鑒定基因插入正確。其他構(gòu)建體pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-WT, pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-Ser321 A, pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-Ser321D, pEGFP-Cdc25B-WT, pEGFP-Cdc

14、25B-Ser321A, pEGFP-Cdc25B-Ser321D為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。
　　 四、體外轉(zhuǎn)錄
　　 pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-WT, pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-Ser321 A, pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-Ser321D，pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε分別取1μg，經(jīng)XbaI酶切線性化，應(yīng)用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒將線性模板體外轉(zhuǎn)錄成帶帽mRNA，然后用2U

15、DNaseI于37℃反應(yīng)15min消化DNA模板，用酚、氯仿抽提純化mRNA，最后應(yīng)用氯化鋰沉淀mRNA。按需要濃度將mRNA溶于TE緩沖液中，用于顯微注射。
　　 五、mRNA顯微注射顯徽注射應(yīng)用Eppendorf Transferman顯微操作系統(tǒng)，OlympusIX-70倒置顯微鏡，DIC調(diào)制相差觀察。顯微注射在含125μmol/L dbcAMP的M2液滴中進(jìn)行，為盡量減少顯微注射對卵母細(xì)胞的影響，一般注入到卵內(nèi)的樣品體積

16、為10p(1)，這相當(dāng)于卵母細(xì)胞體積的5％。mRNA溶解于無核酸酶污染的5mmol/L Tris和0.5mmol/LEDTA(pH7.4)中，稀釋成不同濃度。
　　 六、質(zhì)粒胞核顯微共注射將GV期卵母細(xì)胞移入到M2液滴中，用持卵針將卵細(xì)胞固定，將吸好一定量無內(nèi)毒素的質(zhì)粒pmax-FP-Red-HA-14-3-3ε注射針刺入細(xì)胞將樣品注入胞核，在1小時(shí)后將無內(nèi)毒素pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-WT或pcDNA3.1-MY

17、C-Cdc25B-S321A或pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-S321D的質(zhì)粒注射針刺入細(xì)胞將樣品注入胞核，在含500μmol/L dbcAMP的MB培養(yǎng)液中培養(yǎng)。為盡量減少顯微注射對受精卵的影響，一般注入到受精卵內(nèi)的樣品體積為10p1（相當(dāng)于其總體積的5％）。
　　 七、Stealth siRNA顯微注射14-3-3εStealth siRNA用1ml DEPC處理水稀釋，并儲存于-20℃。GV期卵母細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到含18

18、0mM dbcAMP的M2液滴中，卵母細(xì)胞胞漿被注射5 p1(20μM)的siRNA。顯微注射后的卵母細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到含180mM dbcAMP的MB液滴中，37℃，5％CO2中培養(yǎng)24小時(shí)。
　　 八、RT-PCR檢測GV、GVBD期卵母細(xì)胞中14-3-3蛋白七個(gè)亞型的mRNA水平100個(gè)GV/GVBD期卵母細(xì)胞收集到2ml離心管中，按the EllustraTM QuickPrepMicromRNA Purification試劑

19、盒說明書進(jìn)行:主要包括:樣品的提取，mRNA的分離，分別用高鹽緩沖液和低鹽緩沖液對已結(jié)合mRNA的oligo(dT)纖維顆粒的洗滌，mRNA的洗脫。用TaKaRa RNA PCR(AMV)ver3.0試劑盒，按操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和 PCR:14-3-3beta(NM_018753.6)的引物∶5’-GAACGTGGTAGGTGCCCGCC-3’和5’-GGCCAGGCTGCAGGCCTTTT-3’，預(yù)計(jì)產(chǎn)物長度430bp;14-3-3e

20、psilon(NM_009536.4)的引物:5’-GACCGTGCCTGCAGGTTGC-3’和5’-CTTGCCAGTGTGGCCGGAGA-3’;預(yù)計(jì)產(chǎn)物長度545bp;14-3-3eta(NM_011738.2)的引物:5’-GATATGGCCTCCGCCATGAAGGCG-3’和5’-CATCCTGCTGGTCGCTCGTCCAGAG-3’;預(yù)計(jì)產(chǎn)物長度655bp;14-3-3tau(NM_008839)的引物:5’-GTCT

21、GACGCGCTCTCTCCTCGCT-3’和5’-GGCGGATTGGATGCGTAGGCTG-3’;預(yù)計(jì)產(chǎn)物長度420bp;14-3-3gamma(NM_018871.3)的引物:5’-TCCCTCCGACACACGAGCTCCAA-3’和5’-TGGCCACTTCTGCCAGGTAACG-3’;預(yù)計(jì)產(chǎn)物長度520bp;14-3-3zeta(NM_011740.3)的引物:5’-GTGTCTGCGGAGCGGCTGTAGC-3’和5

22、’-TCTGGTTGCGAAGCATTGG GGA-3’;預(yù)計(jì)產(chǎn)物長度484bp;14-3-3sigma(NM_018754.2)的引物:5’-CAGTTCGCCCGTCTGTCTGTCCA-3’和5’-GATGGGGTTGGTAGGCGGCATC-3’;預(yù)計(jì)產(chǎn)物長度538bp;β-actin(NM_007393.3)作為內(nèi)對照，引物:5’-CGGTCCACACCCGCCACC-3’;和5’-GTCGTCCCAGTTGGTAACAATG

23、CC-3’;預(yù)計(jì)產(chǎn)物長度269bp; PCR反應(yīng)體系為25μl，反應(yīng)條件是①94℃，3min;②94℃，30sec;③50℃，30sec;④72℃，1 min;⑤72℃，10min;②一④循環(huán)30-31周。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后成像。
　　 九、Western印跡收集不同時(shí)期的小鼠母卵細(xì)胞200枚，轉(zhuǎn)移到1.5 ml Eppendorf管中，4℃離心去除培養(yǎng)液，加入20μl蛋白提取緩沖液，反復(fù)凍融裂解，加入SDS樣品緩沖液，

24、100℃煮沸5min，12％ SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，用含5％脫脂奶粉的TBST(pH7.4)室溫封閉1-2h。封閉后的濾膜與MYC抗體、Cdc2-pTyr15磷酸化抗體、HA抗體、14-3-3epsilon抗體及β-Actin抗體4℃孵育過夜。HRP偶聯(lián)的兔抗山羊IgG或羊抗兔IgG作為二抗，室溫孵育2h。洗膜后，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影成像。
　　 十、細(xì)胞免疫熒光定位將培養(yǎng)到指定時(shí)間點(diǎn)的卵細(xì)胞，用含0.1％BSA的PB

25、S作為沈液，洗滌3遍，4％多聚甲醛（融解于PBS中）室溫固定1小時(shí)，或4℃固定過夜，PBST(PBS加0.01％Tween20)洗滌3遍，0.1％ TritonX-100(融解于PBS)打孔30分鐘。用封閉液(含5％BSA的PBS)封閉1小時(shí)，將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入一抗（抗體用封閉液按1∶800稀釋）中4℃過夜，或室溫2小時(shí)，洗液洗滌3次，每次5分鐘，將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入二抗(FITC標(biāo)記IgG用封閉液按1∶100稀釋)中，室溫下孵育1小時(shí)，沈液洗滌

26、3次，每次5分鐘，再用Hoechst33258（10μg/ml溶于PBS中）染色10分鐘，使DNA染色。激光共聚焦掃描顯微鏡觀察、照相。
　　 14-3-3epsilon與Cdc25B的雙染:14-3-3epsilon(一)抗（抗體用封閉液按1∶800稀釋）、Cdc25B(一)抗（抗體用封閉液按1∶100稀釋）孵育4℃過夜后，洗液沈3次，用FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗IgG(1∶100)和TRITC標(biāo)記的兔抗山羊二抗IgG(1∶1

27、00)中孵育1小時(shí)，洗液洗3次后，用Hoechst33258（10μg/ml溶于PBS中）染色10分鐘。最后用激光共聚焦掃描顯微鏡(400×放大率)照相。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每組中至少檢測50個(gè)卵母細(xì)胞。每次實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)置參數(shù)相同。
　　 十一、MPF活性測定收集不同時(shí)期的小鼠卵母細(xì)胞，反復(fù)凍融3次，使細(xì)胞裂解，加入MPF反應(yīng)液25μl，30℃水浴反應(yīng)7 min。取25μl點(diǎn)在Whatman P81強(qiáng)陽離子交換濾紙上，以75mmol

28、/L磷酸溶液終止反應(yīng)后，將濾紙置于含10 ml蒸餾水的液閃瓶內(nèi)，用Beckman液閃計(jì)數(shù)儀測定cpm值。
　　 十二、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液（添加10％胎牛血清FBS，100U/ml青霉素，10μg/ml鏈霉素）培養(yǎng)。用fuGENG6轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。將HEK293細(xì)胞分散于100mm的培養(yǎng)皿(2×106細(xì)胞/皿，10ml含10％ FBS培養(yǎng)液/皿).在24小時(shí)后，細(xì)胞共轉(zhuǎn)染5μg pEGFP-Cdc

29、25B(WT、S321A、S321D、vector)和5μgpmax-FP-Red-HA-14-3-3epsilon DNA十三、細(xì)胞裂解，免疫沉淀和免疫印跡在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞，加入預(yù)冷的RIPA Buffer(50 mM Tris-HCl，0.25％w/v脫氧膽酸鹽，1％NP40，150mM氯化鈉，1 mM EDTA，pH7.4，添加蛋白酶抑制劑混合物和磷酸酶抑制劑混合物）裂解細(xì)胞。蛋白酶抑制劑混合物包括5μg/ml亮抑酶肽，

30、胃酶抑素A，抑肽酶，1 mM苯甲基磺酰氟。磷酸酶抑制劑混合物包括1∶100稀釋的磷酸酶抑制劑cocktailⅡ(Sigma，USA)，25 mM氟化鈉，0.1 mM原釩酸鈉和25 mMβ-甘油酸酯。細(xì)胞裂解液和鼠單克隆抗HA抗體(Covance)、蛋白G-agarose beads(GE Healthcare)共同孵育。沉淀用裂解緩沖液洗。Western blots分析細(xì)胞裂解液和免疫沉淀，鼠單克隆抗HA抗體1∶800(Covance)

31、用于檢測外源性表達(dá)的14-3-3epsilon，抗-GFP抗體1∶8000(Sigma)用于檢測外源性表達(dá)的Cdc25B。
　　 結(jié)果
　　 一、GV期小鼠卵母細(xì)胞14-3-3蛋白亞型鑒定為了證明GV期小鼠卵母細(xì)胞14-3-3蛋白亞型的存在，我們檢查了14-3-3七個(gè)亞型（β，γ，ε，σ，ζ，τ和η）mRNA水平，結(jié)果顯示，在GV期只有14-3-3β和14-3-3ε兩個(gè)亞型存在，而且14-3-3εmRNA水平明顯高于14

32、-3-3β mRNA水平。在蛋白水平上，只檢測到14-3-3ε亞型的存在，14-3-3ε蛋白在GV、GVBD表達(dá)保持恒定，Western blot不能檢測到14-3-3β的存在，認(rèn)為它的表達(dá)量是非常低的。
　　 二、內(nèi)源性14-3-3ε和Cdc25B的共定位用間接免疫熒光方法觀察內(nèi)源性14-3-3ε和Cdc25B的定位，結(jié)果顯示，在GV期，14-3-3ε和Cdc25B共定位于卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。在GVBD前，部分14-3-3ε和C

33、dc25B進(jìn)入細(xì)胞核。在GVBD后，14-3-3ε和Cdc25B均勻的分布于整個(gè)卵母細(xì)胞。這個(gè)結(jié)果說明14-3-3ε和Cdc25B的穿梭伴隨著卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)。
　　 三、Stealth14-3-3εsiRNA抑制14-3-3ε的表達(dá)為了檢測Stealth14-3-3εsiRNA是否可以削減內(nèi)源性的14-3-3ε蛋白水平，在GV期顯微注射control siRNA和14-3-3εsiRNA的卵母細(xì)胞于MB培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。

34、24小時(shí)的培養(yǎng)后，收集卵細(xì)胞進(jìn)行Western Blot和RT-PCR實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示20μM的14-3-3εsiRNA可以較徹底的抑制的抑制內(nèi)源性14-3-3ε的表達(dá)，而control siRNA注射組則相反。
　　 四、敲低14-3-3ε引起部分卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂為了敲低14-3-3ε，我們設(shè)計(jì)了Stealth14-3-3εsiRNA顯微注射GV期小鼠卵母細(xì)胞，在dbcAMP存在的情況下，在注射后24小時(shí)36％的卵母細(xì)胞恢復(fù)

35、減數(shù)分裂，而control siRNA注射組和非注射組并未觀測到GVBD的發(fā)生。
　　 五、Stealth14-3-3εsiRNA對MPF活性的影響和Cdc2-Tyr15磷酸化狀態(tài)的分析在Stealth14-3-3εsiRNA顯微注射后的不同時(shí)間點(diǎn)測定MPF的活性，結(jié)果顯示，MPF的活性在14-3-3εsiRNA顯微注射后24小時(shí)達(dá)到頂峰，而controlsiRNA注射組和非注射組MPF的活性一直保持較低的恒定水平。在14-3-

36、3εsiRNA顯微注射后24小時(shí)Cdc2-Tyr15是脫磷酸化的，control siRNA注射組和非注射組Cdc2-Tyr15是磷酸化的。
　　 六、單獨(dú)注射14-3-3εmRNA及14-3-3ε mRNA和Cdc25B-WT、Cdc25B-S321A或Cdc25B-S321D mRNA共注射對卵母細(xì)胞GVBD率的影響卵母細(xì)胞在顯微注射后在含有200μM dibutyryl cAMP(dbcAMP)的MB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，14-3

37、-3εmRNA and Cdc25B-S321A mRNA共注射組在注射后3小時(shí)時(shí)卵母細(xì)胞的GVBD率是100％(5％ at1h，65％ at2h，and100％ at3h)，在20個(gè)小時(shí)時(shí)有79％的卵母細(xì)胞發(fā)育到MⅡ。而14-3-3εmRNA單獨(dú)注射組和其他共注射組都未發(fā)生GVBD。
　　 七、各種mRNA注射后對MPF活性的影響及Cdc2-Tyr15磷酸化狀態(tài)的分析在各種mRNA注射后，我們測定了MPF活性，檢測了Cdc2-

38、Tyr15的磷酸化狀態(tài)。14-3-3εmRNA and Cdc25B-Ser321A mRNA共注射組MPF活性在卵母細(xì)胞成熟過程中周期性波動(dòng)，在GV期活性最低，在MⅠ和MⅡ升高，排出第一極體后短暫的降低。而在14-3-3εmRNA單獨(dú)注射組和其他共注射組MPF活性一直保持較低的水平。14-3-3εmRNA和Cdc25B-Ser321A mRNA共注射組在注射后3個(gè)小時(shí)，Cdc2-Tyr15是脫磷酸化的，而其他注射組在注射后3個(gè)小時(shí)Cd

39、c2-Tyr15是磷酸化的。說明過表達(dá)14-3-3ε并不影響G2/M的轉(zhuǎn)換。
　　 八、14-3-3ε和Cdc25B結(jié)合位點(diǎn)的鑒定為了測定14-3-3ε和Cdc25B是否能結(jié)合，以及Cdc25B的321位絲氨酸是14-3-3ε和Cdc25B的特異性結(jié)合位點(diǎn)， HEK293細(xì)胞被轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε和pEGFP-Cdc25B-WT或pEGFP-Cdc25B-Ser321A,或pEGFP-Cdc25B-

40、Ser321D或pEGFP-Cdc25B-C3。14-3-3ε用抗HA的瓊脂糖珠子免疫沉淀，接下來用抗HA或抗GFP的抗體檢測Cdc25B與14-3-3ε的結(jié)合。結(jié)果顯示，野生型Cdc25B能與14-3-3ε結(jié)合，然而當(dāng)Cdc25B的321位絲氨酸突變?yōu)楸彼釙r(shí)，Cdc25B與14-3-3ε的結(jié)合被取消，令人有趣的是，Cdc25B的321位絲氨酸突變?yōu)樘於彼釙r(shí)，Cdc25B仍然能結(jié)合14-3-3ε，說明S321D具有模擬磷酸化的作用。

41、提示14-3-3ε只能與可被磷酸化的S321結(jié)合，而不與不能被磷酸化的S321A結(jié)合，Cdc25B的321位絲氨酸是14-3-3ε和Cdc25B結(jié)合的特異性位點(diǎn)。
　　 九、外源性表達(dá)的Cdc25B和14-3-3ε的共定位為了檢測Cdc25B的321位絲氨酸對Cdc25B和14-3-3ε的亞細(xì)胞定位的影響，質(zhì)粒pEGFP-Cdc25B-WT或pEGFP-Cdc25B-Ser321A或pEGFP-Cdc25B-Ser321D和pR

42、FP-HA-14-3-3ε被共注射到GV期卵母細(xì)胞中，注射后卵母細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到含有500μM dbcAMP的MB培養(yǎng)基中允許蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，紅色熒光14-3-3ε與綠色熒光野生型Cdc25B共定位于細(xì)胞質(zhì)，紅色熒光14-3-3ε與綠色熒光突變型Cdc25B-S321A主要共定位于卵母細(xì)胞的細(xì)胞核，紅色熒光14-3-3ε與綠色熒光突變型Cdc25B-S321D分布于整個(gè)卵母細(xì)胞。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步證明Cdc25B的321位絲氨酸對14-3-

43、3εand Cdc25B的亞細(xì)胞定位的確是關(guān)鍵的。
　　 討論
　　 PKA在有絲分裂和減數(shù)分裂阻滯中已經(jīng)被證明是一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)子。我們以前的研究證實(shí)PKA在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)和一細(xì)胞胚胎的發(fā)育中通過使Cdc25B的Ser321的磷酸化和脫磷酸化來調(diào)節(jié)MPF的活性，是MPF的負(fù)性調(diào)節(jié)子。與此同時(shí)，我們也證實(shí)GV期卵母細(xì)胞中S321(Cdc25B)是磷酸化的，GVBD時(shí)是脫磷酸化的。最近，我們課題組通過質(zhì)譜分析證明在

44、體外PKA能磷酸Cdc25B-S321，與Scansite software預(yù)測的位點(diǎn)相一致。因此，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞Cdc25B是PKA的直接底物。這些資料強(qiáng)烈的建議，在高的cAMP存在下，PKA被激活并且磷酸化Cdc25B的S321。磷酸化的Cdc25B反過來抑制Cdc25B的活性，因此卵母細(xì)胞阻滯于G2期。在爪蟾卵母細(xì)胞中的研究表明，蛋白激酶A(PKA)磷酸化Cdc25的287位絲氨酸后通過與14-3-3蛋白的結(jié)合，影響Cdc25的細(xì)

45、胞內(nèi)定位，抑制其活性，卵母細(xì)胞發(fā)生G2期阻滯。
　　 本研究探索了卵母細(xì)胞中是否也存在14-3-3亞型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在GV、GVBD期14-3-3ε恒定表達(dá)，幾乎沒有變化。由于14-3-3β表達(dá)量非常低，WesternBlot不能檢測到它的存在。
　　 14-3-3蛋白是一個(gè)廣泛表達(dá)的酸性蛋白家族，從酵母到哺乳動(dòng)物，幾乎所有真核細(xì)胞都表達(dá)，而且在功能和蛋白序列上非常保守。14-3-3結(jié)合的靶蛋白包含一個(gè)特殊的磷酸化的絲

46、氨酸/蘇氨酸結(jié)構(gòu)域能改變他們的催化活性和亞細(xì)胞定位。本研究的免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)了G2阻滯卵母細(xì)胞14-3-3ε與Cdc25B共定位于細(xì)胞質(zhì)，而在GVBD前Cdc25B穿梭進(jìn)入細(xì)胞核。非常感興趣的是隨著Cdc25B從細(xì)胞質(zhì)穿梭進(jìn)入細(xì)胞核，部分14-3-3ε也從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核。有文獻(xiàn)報(bào)道，14-3-3在沒有結(jié)合的配體存在的情況下，從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核。大量的證據(jù)建議14-3-3蛋白是細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子。我們以前的研究證實(shí)，在卵母細(xì)胞過表達(dá)C

47、dc25B-S321A比過表達(dá)Cdc25B-S321D和Cdc25B-WT能更有效的誘導(dǎo)卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂。這些結(jié)果建議14-3-3可能結(jié)合S321并且抑制了Cdc25B的活性，失活的Cdc25B不能激活MPF。這里，我們的發(fā)現(xiàn)顯示，共表達(dá)14-3-3ε和Cdc25B-S321A能誘導(dǎo)卵母細(xì)胞發(fā)生GVBD，而共表達(dá)14-3-3ε和Cdc25B-S321D和Cdc25B-WT卻不能誘導(dǎo)GVBD的發(fā)生。另外，過表達(dá)14-3-3ε并不影響G

48、2/M的轉(zhuǎn)換。這樣共表達(dá)14-3-3ε抑制了依靠Cdc25B激活MPF活性的能力一定與14-3-3ε結(jié)合Cdc25B-WT有關(guān)，而Cdc25B-S321A卻不受14-3-3ε共表達(dá)的影響，仍有能力誘導(dǎo)減數(shù)分裂的恢復(fù)。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步鞏固了我們了的結(jié)論:14-3-3ε結(jié)合到磷酸化的S321(Cdc25B)并且抑制了Cdc25B的激活。積累的證據(jù)顯示，14-3-3通過結(jié)合Cdc25B負(fù)調(diào)控G2/M的轉(zhuǎn)換，主要是作為腳手架或者是結(jié)合后掩蓋了特殊

49、的結(jié)構(gòu)域如核定位信號(NLS)或核輸出信號(NES)。本實(shí)驗(yàn)的14-3-3ε干涉實(shí)驗(yàn)顯示，下調(diào)14-3-3ε的表達(dá)能引起部分卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂。有報(bào)道顯示，去除結(jié)合于磷酸化Cdc25的14-3-3是G2/M轉(zhuǎn)換的早期步驟，這與我們的報(bào)道非常相似。這樣，PKA磷酸化S321(Cdc25B)，并且結(jié)合14-3-3ε于細(xì)胞質(zhì)，使卵母細(xì)胞阻滯于G2期，當(dāng)敲低14-3-3ε時(shí)，Cdc25B激活胞漿中的MPF，從而啟動(dòng)減數(shù)分裂的恢復(fù)。
　　

50、 本研究證實(shí)了一個(gè)相似的機(jī)制，14-3-3ε是通過S321(Cdc25B)來調(diào)節(jié)Cdc25B的活性的。14-3-3ε能結(jié)合野生型Cdc25B，而當(dāng)Cdc25B-S321突變?yōu)镃dc25B-S321A，14-3-3ε與Cdc25B的結(jié)合被取消。本研究通過外源表達(dá)的14-3-3ε與Cdc25B的定位實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的成熟過程中14-3-3ε決定著Cdc25B的定位。
　　 綜上所述，我們首次提出在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中

51、，PKA/Cdc25B/14-3-3ε通路的可能作用機(jī)制，PKA通過Cdc25B的321位絲氨酸的磷酸化修飾，導(dǎo)致14-3-3ε蛋白與Cdc25B結(jié)合于細(xì)胞質(zhì)，結(jié)合后掩蓋了Cdc25B蛋白上的核定位信號，NLS被掩蓋后不能介導(dǎo)Cdc25B入核，因此Cdc25B蛋白的出核與入核的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，出核速率大于入核速率，細(xì)胞核內(nèi)的Cdc25B含量減少，不能激活MPF，因而發(fā)生G2期阻滯。當(dāng)cAMP水平下降，Cdc25B被一種未知的磷酸酶脫磷酸

52、而激活，接著從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，使Cdc2的Thr14和Tyr15脫磷酸，這樣激活MPF，卵母細(xì)胞發(fā)生GVBD。再后，Cdc25B可能又由細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)。我們的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步解釋了14-3-3ε介導(dǎo)的抑制Cdc25B活性使卵母細(xì)胞阻滯于G2期。
　　 總之，我們的發(fā)現(xiàn)不僅證實(shí)了鼠卵母細(xì)胞PKA/Cdc25B-S321/14-3-3ε途徑的作用，而且也提出了一個(gè)新的模式，在G2/M轉(zhuǎn)換時(shí)，14-3-3ε通過使Cdc25B細(xì)胞內(nèi)再定位來

53、調(diào)節(jié)它的活性。
　　 結(jié)論：
　　 1、在卵母細(xì)胞GV、GVBD期14-3-3ε的表達(dá)恒定沒有改變。14-3-3ε在卵母細(xì)胞的G2阻滯中起著重要的作用。14-3-3ε和Cdc25B能在卵母細(xì)胞核中進(jìn)行穿梭。
　　 2、14-3-3ε控制著Cdc25B的細(xì)胞質(zhì)定位。Cdc25B的321位絲氨酸對Cdc25Band14-3-3ε細(xì)胞內(nèi)定位起著關(guān)鍵的決定性作用3、Cdc25B的321位絲氨酸是14-3-3ε和Cdc25