Nek9和ERK8在小鼠卵母細(xì)胞成熟中的作用和早期胚胎中定位.pdf

1、小鼠卵母細(xì)胞成熟是一多階段精細(xì)有序調(diào)控的過程。小鼠卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂標(biāo)志著卵母細(xì)胞成熟的開始。生發(fā)泡破裂后，微管在前中期圍繞染色體開始組裝，染色體逐漸遷移至紡錘體的中部，而后者在MⅠ期形成橢圓形雙極結(jié)構(gòu)。隨后，紡錘體遷移至細(xì)胞皮質(zhì)，并排出第一極體，細(xì)胞進(jìn)入第二次減數(shù)分裂中期，在此期紡錘體緊貼于質(zhì)膜下方。目前卵母細(xì)胞在胞漿中含有超過80個小的微管組織中心蛋白。有絲分裂體細(xì)胞中心體形成雙極紡錘體的兩極，促進(jìn)微管成核和紡錘體裝配。減數(shù)分裂卵母

2、細(xì)胞微管組織中心含有圍中心粒物質(zhì)成分:γ-tubulin and pericentrin，后者是一種關(guān)鍵蛋白，用于把γ-tubulin固定在中心粒周圍。在前中期，微管組織中心開始聚集以形成紡錘體極。卵母細(xì)胞微管組織中心的功能與有絲分裂細(xì)胞中心體類似，對減數(shù)分裂紡錘體組裝是必須的，但微管組織中心的組成結(jié)構(gòu)及如何調(diào)節(jié)微管成核和組裝機(jī)制目前并沒有很好闡明。NIMA蛋白激酶是以構(gòu)巢曲霉菌蛋白激酶命名的一種激酶，參與廣泛的有絲分裂進(jìn)程。哺乳動物的

3、NIMA基因編碼11種NIMA激酶，報(bào)道顯示NIMA蛋白激酶家族是有絲分裂進(jìn)展中的關(guān)鍵分子，參與了許多重要的有絲分裂過程，如有絲分裂前期中的中心體分離，染色體濃縮，前中期中的核膜破裂和紡錘體組裝，以及有絲分裂周期的退出和細(xì)胞骨架分離。Nek9屬于NIMA蛋白激酶家族，是一分子量107kD的多肽，它的氨基催化末端連接有一段與RCC1同源的序列，后者是小G蛋白Ran的交換因子。在細(xì)胞分裂間期，Nek9的RCC1區(qū)域可以直接與激酶的活性部位結(jié)

4、合起自身抑制作用。哺乳動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Nek9與γ-tubulin蛋白共沉淀，并且激活的Nek9多肽在早期細(xì)胞分裂過程中定位于中心體和紡錘體極上。Nek6和Nek7激酶是Nek9的下游激酶，激活后促進(jìn)有絲分裂進(jìn)展，而如果敲減其活性或表達(dá)活性衰減的突變體則導(dǎo)致有絲分裂阻滯和細(xì)胞凋亡。PLK1激酶可以激活Nek9，促使有絲分裂驅(qū)動蛋白Eg5蛋白上Ser1033磷酸化，后者與CDK1激酶一起，對中心體分離和及時進(jìn)入有絲分裂周期起關(guān)鍵作用。絲裂原

5、激活蛋白激酶系統(tǒng)(MAPK)是一組蘇/絡(luò)氨酸蛋白激酶家族，參與一系列的包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)等關(guān)鍵的細(xì)胞生命進(jìn)程。ERK8是胞外信號調(diào)節(jié)激酶家族(ERK)中新發(fā)現(xiàn)的蛋白激酶，與ERK7擁有69％相同的氨基酸序列。ERK8促進(jìn)增生細(xì)胞核抗原蛋白(proliferating cell nuclear antigen;PCNA)的穩(wěn)定，后者參與基因信息的傳送、協(xié)調(diào)、和刺激過程。目前已知(Humandouble minute2;HD

6、M2)蛋白參與PCNA降解過程。ERK8可以阻止PCNA和HDM2結(jié)合從而抑制PCNA降解。ERK8還參與調(diào)控細(xì)胞周期。降低ERK8表達(dá)影響正常的細(xì)胞增殖。在MCF-10A細(xì)胞，ERK8是調(diào)節(jié)增殖速率的限速因子，控制細(xì)胞進(jìn)入S期。降調(diào)ERK8導(dǎo)致cyclin D1、cyclin E、p27表達(dá)增高，和cyclin A水平下調(diào)。降調(diào)ERK8表達(dá)后，細(xì)胞增殖速率下降大約2倍。不過，ERK8的功能仍不清楚，關(guān)于其上游激活成分和下游效應(yīng)蛋白的信

7、息仍了解很少。其在減數(shù)分裂中的作用也不清楚?？紤]到減數(shù)分裂過程的精確調(diào)控對于可受精的卵子的產(chǎn)生及后代的健康十分重要。目前關(guān)于Nek9和ERK8激酶的研究主要集中在有絲分裂中方面，對于他們在哺乳動物減數(shù)分裂中的作用及其在早期受精卵中的研究尚未見報(bào)道，我們提出了Nek9和ERK8在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程和早期受精卵卵裂中發(fā)揮作用的假設(shè)。系統(tǒng)研究了他們在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中的表達(dá)、定位、功能情況以及其在受精卵早期胚胎中的分布情況。本研

8、究包括兩個部分。
　　 第一章 Nek9調(diào)節(jié)小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂紡錘體組裝和細(xì)胞周期進(jìn)展及其在早期胚胎中的分布
　　 目的:Nek9在有絲分裂中起重要作用，但其是否參與減數(shù)分裂過程中無中心體的紡錘體組裝和染色體的分離調(diào)控還有待研究。本研究探討其在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中的表達(dá)、定位、功能情況以及其在受精卵早期胚胎中的分布情況。
　　 方法:我們先后進(jìn)行卵母細(xì)胞和受精卵培養(yǎng)、對各期卵母細(xì)胞或受精卵早期胚胎進(jìn)行免疫

9、印跡試驗(yàn)、免疫熒光試驗(yàn)和激光共聚焦掃描檢測;紫杉醇和諾考達(dá)唑處理減數(shù)分裂中期的卵母細(xì)胞;Morpholino顯微注射、染色體鋪片實(shí)驗(yàn)、活細(xì)胞動態(tài)觀察錄像實(shí)驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)方法，探討其在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程具體的作用和早期受精卵卵裂中的分布。獨(dú)立重復(fù)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，觀察的卵子數(shù)目用括號表示(n=)。用SPSS軟件進(jìn)行差異分析。p＜0.05被定義為差異顯著。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:Nek9在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟中均有表達(dá)和

10、定位:Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，Nek9在卵母細(xì)胞成熟的各個階段都有表達(dá)，且各期表達(dá)量并無明顯差異。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示GⅤ期，Nek9定位在生發(fā)泡內(nèi)。生發(fā)泡破裂后，Nek9聚集在濃縮的染色體周圍，在Pro-MⅠ、MⅠ期，Nek9主要定位在紡綞體的兩極上。在在第一次減數(shù)分裂的后期和末期，Nek9主要定位在分離的同源染色體中間和卵母細(xì)胞和極體間的中體上。在MⅡ期，Nek9再次回到紡綞體的兩極上。Nek9與γ-tubulin共定位進(jìn)一步證

11、實(shí)Nek9在減數(shù)分裂期主要分布在紡錘體的兩極上。Nek9在受精卵和早期有絲分裂期胚胎中的亞細(xì)胞定位與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂相類似。當(dāng)卵母細(xì)胞進(jìn)入第二次減數(shù)分裂的末期并排出第二極體，Nek9遷移至細(xì)胞中體上。在受精卵兩原核期中，Nek9呈點(diǎn)狀分布在受精卵原核內(nèi)。隨著原核的破裂，Nek9開始在染色體周圍聚集，有絲分裂紡錘體開始形成。在前中期和中期，Nek9穩(wěn)定的表達(dá)在第一次有絲分裂紡錘體的兩極上。當(dāng)合子進(jìn)入第一次有絲分裂后期和末期時，Nek9移動

12、到已分離染色體之間的中部或細(xì)胞中體，當(dāng)?shù)谝淮斡薪z分裂完成后，受精卵形成2細(xì)胞胚胎間期，Nek9再一次出現(xiàn)在細(xì)胞核內(nèi)。當(dāng)用紡錘體干擾劑處理減數(shù)分裂中期中的卵母細(xì)胞后，我們發(fā)現(xiàn)在紫杉醇處理組的卵子中，Nek9和γ-tubulin信號不僅在異常的紡錘體極上出現(xiàn)并完全重疊，同時也出現(xiàn)在異常的胞質(zhì)星體上。在諾考達(dá)唑處理的卵子，微管完全解聚，紡錘體消失，Nek9信號消失在胞漿中。當(dāng)諾考達(dá)唑處理的MⅠ期卵子徹底清洗并培養(yǎng)30分鐘來促進(jìn)微管的再組裝，N

13、ek9又重新出現(xiàn)在重組的紡錘體細(xì)胞器的兩極上。接下來我們采用在卵子中采用Morpholino(MO)抑制Nek9表達(dá)，觀察卵母細(xì)胞Nek9受到抑制后其減數(shù)分裂的發(fā)生情況。免疫印跡分析顯示Morpholino處理組Nek9的表達(dá)明顯降低，證明Nek9敲減效率是成功的。在Nek9-MO處理組，卵母細(xì)胞表現(xiàn)出多種形態(tài)異常的有缺陷的紡錘體和排列紊亂的染色體。主要的紡錘體紊亂是異常的紡錘體極，(52％，n=94)主要包括:無極，單級，多極紡錘體，

14、其他紊亂包括超長的紡錘體，和異形的紡錘體伴有星型微管，并出現(xiàn)明顯的染色體排列異常。Nek9-MO注射處理組異常紡錘體的比例(62.2±1.6％，n=94)明顯高于對照組(26.1±1.3％，n=92)(p＜0.05)。而且，Nek9-MO處理組排列紊亂染色體的比例(69.2±0.6％，n=94)與對照組相比(28.1±2.3％，n=92)也有顯著差異。我們的研究發(fā)現(xiàn)，Nek9在減數(shù)分裂成熟過程中始終和γ-tubulin共定位，接下來，我

15、們進(jìn)一步研究了Nek9敲減后對γ-tubulin的作用。在對照MO組，γ-tubulin在MⅠ期位于紡錘體的兩極，而在Nek9-MO顯微注射處理組，γ-tubulin不再聚集在紡錘體的兩極，而是不規(guī)則的散落在紡錘體纖維上或彌散在細(xì)胞漿中。由于Nek9敲減影響了紡錘體組裝而導(dǎo)致大量卵子阻滯在前中期和中期，我們推測染色體是否也不能得到正確的分離。我們將Nek9MO處理組和對照組的卵子培養(yǎng)12小時后進(jìn)行染色體鋪片分析。染色體鋪片證實(shí)Nek9降

16、調(diào)后影響了染色體分離。在Nek9降調(diào)組，染色體鋪片顯示染色體仍為2倍體，(10/10);而在對照組卵母細(xì)胞，同源染色體已分離，染色體為單倍體形式(9/9)，提示后期已完成。接下來，我們研究了檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白Bub3在Nek9-MO處理組卵母細(xì)胞的分布情況。在Nek9-MO實(shí)驗(yàn)組，細(xì)胞即使經(jīng)過10小時培養(yǎng)仍阻滯在前中期或中期，特異性的檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白Bub3信號仍可以被檢測出。而在對照組，細(xì)胞進(jìn)入后期，Bub3信號消失， Bub3信號提示在Nek9降

17、調(diào)后，紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)被激活。最后，我們采用活細(xì)胞實(shí)時攝像顯示:在對照組，生發(fā)泡破裂后4小時可觀察到減數(shù)分裂紡錘體，并且紡錘體緩慢移至卵子皮質(zhì)，并大約在生發(fā)泡破裂后9小時排出第一極體。形成對比的是，在Nek9-MO顯微注射處理組，各種不同的形態(tài)缺陷的紡錘體可以被觀察到，染色體不能分離，甚至在生發(fā)泡破裂后12小時后還能發(fā)現(xiàn)卵子被阻滯在前中期或中期。而且，在Nek9-MO顯微注射處理組中，沒有發(fā)現(xiàn)有第一極體排出。
　　 結(jié)論:我們的研究

18、顯示Nek9可能是一種中心體相關(guān)蛋白，在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中對紡錘體組裝，紡錘體極形成，染色體排列，第一極體排出都起重要作用。
　　 第二章ERK8在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中的作用和在早期胚胎中的分布
　　 目的:研究ERK8在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中的表達(dá)、定位、在受精卵早期胚胎中的分布情況，以及其在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過程中的作用。
　　 方法:我們先后進(jìn)行卵母細(xì)胞和受精卵培養(yǎng)、對各期卵母細(xì)胞或受精卵早

19、期胚胎進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)、免疫熒光試驗(yàn)和激光共聚焦檢測、紫杉醇和諾考達(dá)唑處理減數(shù)分裂中期的卵母細(xì)胞、siRNA或抗體顯微注射等實(shí)驗(yàn)方法，探討其在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程具體的作用和早期受精卵卵裂中的分布。獨(dú)立重復(fù)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，觀察的卵子數(shù)目用括號表示(n=)。用SPSS軟件進(jìn)行差異分析。p＜0.05被定義為差異顯著。
　　 結(jié)果:ERK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:ERK8在卵母細(xì)胞成熟的各個階段都有表達(dá)，且各期表達(dá)量并無明顯

20、差異。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示在GⅤ期，ERK8未發(fā)現(xiàn)有明確的定位。在生發(fā)泡破裂后，ERK8開始遷移至染色體的周圍。在第一次減數(shù)分裂前中期、中期、后期、末期和第二次減數(shù)分裂中期，ERK8穩(wěn)定地分布在紡錘體微管上。ERK8信號和α-tubulin信號共染實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)ERK8在減數(shù)分裂中的定位。受精卵和早期有絲分裂期胚胎免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示在兩原核期受精卵，未發(fā)現(xiàn)明顯的ERK8信號。當(dāng)原核核膜破裂后，ERK8開始聚集在染色體的周圍并開始定位在有絲分裂

21、紡錘體微管上。當(dāng)受精卵進(jìn)入有絲分裂后期， ERK8信號仍和α-tubulin有著同樣的定位方式。當(dāng)?shù)谝淮斡薪z分裂完成，形成二細(xì)胞胚胎且細(xì)胞均進(jìn)入間期時，和在原核期類似，此時無ERK8信號被檢測到。在觀察到ERK8在第一次和第二次減數(shù)分裂中期均定位在紡錘體上之后，我們研究了其與微管的相關(guān)關(guān)系。紫杉醇是一種微管穩(wěn)定劑，紫杉醇處理的卵母細(xì)胞微管紡錘體過度聚集，并且在胞質(zhì)中形成典型和眾多的星體，ERK8信號出現(xiàn)在異常的紡錘體上和胞質(zhì)星體上。接下

22、來，用諾考達(dá)唑處理MⅠ和MⅡ期卵母細(xì)胞使其微管降解，經(jīng)過10分鐘諾考達(dá)唑處理，微管已完全解聚，此時ERK8從紡錘體消失，彌散在胞質(zhì)中。為了研究ERK8在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中的作用，我們首先采用抗體注射破壞ERK8蛋白的生物學(xué)活性。我們用ERK8抗體或免疫球蛋白G注射生發(fā)泡期的卵母細(xì)胞。在ERK8抗體注射組，卵母細(xì)胞顯示出各種不同類型的紡錘體缺陷和排列異常的染色體表型。主要的紡錘體異常是無極紡錘體。其他的異常包括單極紡錘體、多極紡錘體、

23、多極紡錘體和小紡錘體、長紡錘體和非成型的紡錘體伴有胞質(zhì)星體。ERK8抗體注射組在出現(xiàn)嚴(yán)重紡錘體異常的同時多半也伴有染色體排列紊亂，包括輕度排列紊亂和嚴(yán)重排列異常。與對照組(23.2％±2.7％，n=217)相比， ERK8抗體注射組(57.1％±4.9％，n=185，p＜0.05)紡錘體異常比例明顯增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ERK8抗體注射組中(60.4％±3.8％,n=185)染色體異常比例同時也較對照組(20.6％±1.8％，n=217，

24、p＜0.05)明顯增加。我們進(jìn)一步采用ERK8 siRNA干擾觀察卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟情況。在ERK8-siRNA降調(diào)組，大多數(shù)卵母細(xì)胞表現(xiàn)出明顯異常的紡錘體和染色體表型。ERK8-siRNA顯微注射組異常紡錘體比例(59.3±3.5％，n=159)較對照組(25.3±1.5％，n=155)明顯增加，(p＜0.05)。ERK8 siRNA降調(diào)組染色體異常比例(60.5±3.8％，n=159)與對照組(30.6±3.4％，n=155，p＜

25、0.05)相比，也明顯增加。最后，我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)ERK8 siRNA組卵母細(xì)胞被阻滯在前中期/中期，而對照組細(xì)胞多數(shù)進(jìn)入MⅡ期，ERK8 siRNA組極體排放率(31.1±2.8％，n=144)明顯低于對照組極體排放率(63.4±4.2％，n=157，p＜0.05)。與ERK8 siRNA干擾試驗(yàn)結(jié)果相似，ERK8抗體顯微注射組的極體排放率(35.3±5.7％，n=114)明顯低于對照免疫球蛋白注射組(72.7±2.8％，n=125，p