MCUR1介導線粒體鈣穩(wěn)態(tài)重塑調(diào)控ROS產(chǎn)生促進肝癌生長的作用機制研究.pdf

1、線粒體鈣穩(wěn)態(tài)對線粒體功能及細胞的影響至關重要，線粒體鈣維持胞漿鈣離子濃度動態(tài)平衡，是線粒體呼吸功能的重要調(diào)節(jié)因素，鈣離子失衡導致細胞凋亡。線粒體鈣穩(wěn)態(tài)重塑是多種疾病發(fā)生的主要原因，但這一改變是否在腫瘤惡性進展中發(fā)揮關鍵作用尚無明確報道。我們的研究團隊首次發(fā)現(xiàn)：新近報道的線粒體鈣離子攝取關鍵調(diào)節(jié)分子MCUR1，促進肝癌細胞粒體鈣穩(wěn)態(tài)攝取，其表達水平在肝癌組織細胞中異常升高，MCUR1高表達能夠通過加速細胞增殖抑制線粒體依賴的內(nèi)源性細胞凋亡

2、而促進了肝癌細胞的生長能力，并且與肝癌病人的不良預后相關。文獻報道，線粒體的鈣離子環(huán)境是調(diào)控細胞活性氧 ROS生成的關鍵因素，而活性氧ROS作為胞內(nèi)重要的第二信使，能夠激活包括與腫瘤細胞增殖，凋亡，轉(zhuǎn)移與腫瘤細胞的血管生成相關的多種關鍵信號通路，最終導致惡性腫瘤發(fā)生。我們進一步研究發(fā)現(xiàn)MCUR1介導的線粒體鈣穩(wěn)態(tài)重塑導致肝癌細胞活性氧ROS水平上調(diào)，這一改變與其下游P53降解，AKT/MDM2信號通路活化密切相關?；诖?，我們提出假說：

3、MCUR1上調(diào)引發(fā)線粒體鈣穩(wěn)態(tài)重塑，通過調(diào)控胞內(nèi)第二信使ROS生成影響其下游AKT/MDM2介導的P53降解信號通路，最終促進肝癌的惡性進展。
　　【目的】
　　本課題以肝癌為研究對象，選擇線粒體鈣離子攝取關鍵調(diào)節(jié)分子MCUR1，明確MCUR1介導的線粒體鈣穩(wěn)態(tài)重塑是否參與對肝癌生長的調(diào)控，并探索MCUR1介導的線粒體鈣穩(wěn)態(tài)重塑調(diào)控肝癌生長的作用機制。
　　【方法】
　　1.利用免疫組化實驗分析MCUR1以及P5

4、3在原發(fā)性肝癌臨床標本的表達及相關性。
　　2.利用MTS法測定細胞生長曲線、克隆形成實驗、Annexin-V凋亡檢測、流式細胞周期檢測、EdU細胞增殖等實驗方法，分析MCUR1對肝癌細胞增殖凋亡及生長的影響。
　　3.利用裸鼠皮下荷瘤實驗，分析MCUR1在體內(nèi)對肝癌生長的影響。
　　4.利用Rhod-2, Fluo-4活細胞染色，分析MCUR1對肝癌細胞線粒體基礎鈣離子水平以及線粒體對胞漿鈣的緩沖作用的影響。

5、　　5.利用DCF及MitoSox染料對細胞ROS及線粒體ROS進行染色，分析MCUR1對肝癌細胞線粒體ROS生成的影響。
　　6.利用WesternBlot檢測凋亡相關分子，以及增殖相關分子的表達改變，分析MCUR1介導的線粒體鈣穩(wěn)態(tài)重塑促進肝癌細胞的生長的作用機制。
　　【結(jié)果】
　　第一部分：通過對原發(fā)性肝癌臨床標本進行分析，發(fā)現(xiàn)MCUR1在肝癌組織中表達上調(diào)，與肝癌不良預后相關。通過采用MTS法測定細胞生長曲線

6、、克隆形成實驗、Annexin-V凋亡檢測、流式細胞周期檢測、EdU細胞增殖等實驗方法，發(fā)現(xiàn)肝癌細胞中MCUR1通過抑制細胞凋亡并且加速細胞增殖而促進肝癌細胞的生長。通過進行裸鼠皮下荷瘤實驗，證實MCUR1通過抑制肝癌凋亡，加速肝癌增殖，而促進肝癌的生長。
　　第二部分：通過Rhod-2, Fluo-4染色檢測線粒體鈣以及胞漿鈣，發(fā)現(xiàn)：MCUR1能夠促進線粒體鈣離子攝入，提升線粒體基礎鈣離子濃度，并且在應急狀態(tài)下線粒體對胞漿鈣的緩

7、沖力。通過對線粒體單向轉(zhuǎn)運體MCU進行干預處理，發(fā)現(xiàn)MCUR1依賴于MCU促進肝癌細胞線粒體鈣的攝取。
　　第三部分：通過對細胞ROS以及線粒體ROS的檢測，發(fā)現(xiàn)MCUR1能夠促進肝癌細胞線粒體ROS生成。通過線粒體的ROS清除劑Mito-TEMPO對細胞中線粒體ROS進行清除，以及線粒體鈣清除載體PV-Mito對線粒體內(nèi)的鈣離子進行清除，發(fā)現(xiàn)MCUR1介導的線粒體鈣離子穩(wěn)態(tài)重塑通過促進肝癌細胞線粒體ROS生成，而抑制細胞凋亡促進