TIEG1基因在TGF-β1介導(dǎo)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制中的作用及抗腫瘤研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開(kāi)： 第一部分TIEG1基因在TGF—β1介導(dǎo)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制中的作用 研究背景：肝癌是世界上第五大惡性腫瘤，晚期患者治療難度大、療效差，目前尚無(wú)有效的治療策略。因此研究肝癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和療法是目前研究熱點(diǎn)。TGF—β在體外能抑制肝細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在體內(nèi)控制肝細(xì)胞的生長(zhǎng)，維持肝臟大小。然而，在肝癌細(xì)胞中，往往對(duì)TGF—β失去敏感性，被認(rèn)為是肝癌發(fā)病的機(jī)制之一，但其機(jī)理尚未完全

2、闡明。 研究目的：通過(guò)篩選對(duì)TGF—β1不同敏感程度的細(xì)胞株(包括正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞)，以此為模型，研究肝癌細(xì)胞對(duì)TGF—β敏感性缺失的主要原因以及TIEG1抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制。 研究方法：選取了對(duì)TGF—β敏感的肝癌細(xì)胞株Hep3B和正常永生化的肝細(xì)胞株MIHA，以及對(duì)TGF—β不敏感的兩株肝癌細(xì)胞株(HepG2、Bel7404)做為細(xì)胞模型。TGF—β1處理0、0.5、1、2、4h后，RF—PCR方法檢測(cè)T

3、GF—β不同敏感程度的細(xì)胞株之間TGF—β信號(hào)通路主要相關(guān)基因表達(dá)的差異；利用siRNA抑制TGF—β敏感肝癌細(xì)胞Hep3B的TIEG1表達(dá)，觀(guān)察細(xì)胞對(duì)TGF—β1敏感性的改變；利用慢病毒載體在TGF—β不敏感肝癌細(xì)胞(HepG2、Bel7404)中過(guò)表達(dá)TIEG1，研究TIEG1在TGF—β1對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制中的作用。Westernblot檢測(cè)TGF—β1和TIEG1對(duì)stathmin表達(dá)的影響；螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)TIEG1對(duì)st

4、athmin啟動(dòng)子的調(diào)控；采用染色質(zhì)免疫共沉淀方法，觀(guān)察TIEG1對(duì)stathmin啟動(dòng)子區(qū)域的直接結(jié)合作用；并進(jìn)一步在TIEG1過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞中同時(shí)過(guò)表達(dá)stathmin，研究對(duì)逆轉(zhuǎn)TIEG1抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。 研究結(jié)果：(1)在檢測(cè)TGF—β1處理細(xì)胞后的早期基因反應(yīng)中，發(fā)現(xiàn)在TGF—β敏感的細(xì)胞(Hep3B、MIHA)中，TGF—β1能強(qiáng)烈誘導(dǎo)TIEG1基因表達(dá)上調(diào)(7～11倍)，并在1h時(shí)達(dá)到高峰；而在對(duì)TGF—β不

5、敏感的細(xì)胞(HepG2、Bel7404)中，TIEG1基因表達(dá)只有微弱的上調(diào)(2～3倍)，TGF—β敏感的細(xì)胞中TIEG1基因表達(dá)變化顯著高于TGF—β不敏感的細(xì)胞。(2)應(yīng)用siRNA抑制TGF—β敏感肝癌細(xì)胞Hep3B中TIEG1基因表達(dá)，可以使Hep3B細(xì)胞對(duì)TGF—β1的敏感性降低。(3)在TGF—β不敏感的肝癌細(xì)胞(HepG2、Bel7404)中過(guò)表達(dá)TIEG1，可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)凋亡。(4)TIEG1可以通過(guò)直接結(jié)

6、合stathmin啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控啟動(dòng)子活性，下調(diào)stathmin的表達(dá)；TGF—β1處理敏感肝癌細(xì)胞Hep3B也可使stathmin表達(dá)下調(diào)。(5)在TIEG1過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞中同時(shí)過(guò)表達(dá)stathmin，可以明顯逆轉(zhuǎn)TIEG1對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。 結(jié)論：(1)TGF—β1處理后，TIEG1基因早期表達(dá)反應(yīng)能力的減弱，是導(dǎo)致肝癌細(xì)胞對(duì)TGF—β1喪失敏感性的主要原因。(2)闡明了TGF—β1對(duì)TIEG1基因及下游stat

7、hmin的調(diào)控作用，提出假設(shè)的“TGF—β1→TIEG1→stathmin→細(xì)胞增殖抑制”新的信號(hào)通路，揭示TIEG1基因在TGF—β1介導(dǎo)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制中的重要作用。本研究為探討肝癌發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第二部分慢病毒載體過(guò)表達(dá)TIEG1對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和化療藥物的增敏作用 研究背景：胰腺癌是目前已知的惡性程度最高的腫瘤之一。近年來(lái)，人胰腺癌的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)

8、量。大部分胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥，導(dǎo)致胰腺癌預(yù)后極差。尋找更加有效的治療方法，成為目前胰腺癌治療的關(guān)鍵。TIEG1可以誘導(dǎo)TGF—β敏感胰腺癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，但對(duì)TGF—β不敏感胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和化療藥物敏感性的影響尚未闡明。 研究目的：研究在胰腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)TIEG1對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和化療藥物敏感性的影響，并探討其作用機(jī)制。 研究方法：利用慢病毒轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，在胰腺癌細(xì)胞株(SW1990和Canpan-2)以及

9、永生化正常胰腺導(dǎo)管細(xì)胞株(HPDE6—E6E7—c7)中過(guò)表達(dá)TIEG1，MTT法測(cè)定其對(duì)胰腺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的差異；DAPI染色法檢測(cè)TIEG1對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響；MTT法測(cè)定過(guò)表達(dá)TIEG1后，胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物吉西他濱敏感性的改變；實(shí)時(shí)定量PCR和Westernblot方法檢測(cè)TIEG1對(duì)胰腺癌細(xì)胞stathmin表達(dá)的影響；用慢病毒過(guò)表達(dá)stathmin，研究對(duì)逆轉(zhuǎn)TIEG1抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用；利用特異性

10、siRNA抑制stathmin的表達(dá)，觀(guān)察對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 研究結(jié)果：(1)慢病毒載體過(guò)表達(dá)TIEG1基因能抑制胰腺細(xì)胞生長(zhǎng)，并且在腫瘤細(xì)胞中抑制效果明顯高于正常胰腺癌細(xì)胞株，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)過(guò)表達(dá)TIEG1基因可以誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物吉西他濱的敏感性。(3)TIEG1可以下調(diào)胰腺癌細(xì)胞stathmin的表達(dá)；同時(shí)用慢病毒轉(zhuǎn)染方法過(guò)表達(dá)stathmin可以一定程度逆轉(zhuǎn)TIEG1基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的